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摘要:为了研究壳聚糖酶的水解活性,实验进行了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶基因编码序列的克隆,并构建了谷胱甘肽转移酶(GST)-壳聚糖酶融合蛋白表达质粒,在大肠杆菌中表达后提取、纯化得到重组蛋白,并通过生物信息学对该蛋白的信号肽、三维结构等进行了分析,最后以胶态壳聚糖溶液为底物研究了该重组壳聚糖酶的活性.结果显示,该壳聚糖酶基因的ORF长为837 bp,编码279个氨基酸,分子量为31.45 ku.在其氨基末端具有信号肽,切割点位于36和37位氨基酸之间.氨基酸序列同源性分析表明该壳聚糖酶属于GH46家族糖苷水解酶.酶的水解活性最适温度约为55°C,最适pH为5.5.而金属离子Fe3+、Ag+、Cu2+、Ba2+和K+对其水解活性都起抑制作用,但是Mn2+、Ca2+和Mg2+对其活性起增强作用.0.1 mmol/L的Zn2+对壳聚糖酶的活性起增强作用,2.0 mmol/L的Zn2+对壳聚糖酶的活性起抑制作用.本实验研究了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶在不同条件下的水解活性,为壳聚糖酶的工业应用奠定了理论基础.
[硕士论文] 段静
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:甲壳素在自然界中的含量极其丰富,是仅次于纤维素的第二大多聚物,壳聚糖可由甲壳素制备而得。壳聚糖降解产物在医学、农业、工业等多个行业中都有着很高的应用价值,比如,壳寡糖可以显著提高鱼类的免疫力,是优良的水产饲料添加剂。由于壳聚糖的分子量大,溶解度低,使得其直接应用往往具有较大的局限性。因此,探索对壳聚糖进行高效降解具有重要的理论和生产意义。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是广泛存在于自然界中的芽孢杆菌属的成员。利用以壳聚糖为唯一碳源的选择性培养基,我们筛选到一株可以高效降解壳聚糖的解淀粉芽孢杆菌,并开展其壳聚糖酶活性的研究,得到如下结果:
  1、根据细菌的形态、生理生化特征,并结合16S rDNA和gyrA基因,鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌,并对该菌株进行命名为HZ-1510。
  2、克隆了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510的壳聚糖酶基因,通过生物信息学技术分析了该基因的结构,该壳聚糖酶基因开放读码框全长为837bp,可以编码279个氨基酸,分子量大小为31.45kDa。在其氨基末端具有信号肽,切割点位于第36位和37位氨基酸之间。氨基酸序列同源性分析结果显示该壳聚糖酶属于GH46家族,与解淀粉芽孢杆菌ABBD菌株和MBE1283菌株所编码的壳聚糖酶同源性最高。此外,Glu-55和Asp-71氨基酸为该壳聚糖酶的催化活性位点。
  3、构建谷胱甘肽转移酶(GST)-壳聚糖酶融合蛋白表达质粒pGEX-5X-1-Chi,在大肠杆菌BL21中表达,利用GST亲和层析柱纯化壳聚糖酶。
  4、研究了温度、pH和金属离子对重组壳聚糖酶的水解活力的影响,结果表明,该重组壳聚糖酶的最适反应温度约为55℃,最适pH为5.5。金属离子Mn2+、Ca2+和Mg2+对其活力起增强作用,但Fe3+、Ag+、Cu2+、Ba2+和K+对其水解活力都起抑制作用。低浓度的Zn2+对壳聚糖酶的活力起到了微弱的增强效果,但提高Zn2+的浓度会使壳聚糖酶的活力起抑制作用。
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