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[硕士论文] 武星彤
农业昆虫与害虫防治 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri(Hughes)隶属于植绥螨科Phytoseiidae新小绥螨属Neoseiulus。巴氏新小绥螨是诸多吸汁性农业害虫的重要捕食性天敌,在农林作物生物防治应用方面,具有较广的应用前景和极其重要的应用价值。前期研究证实在基础饲料中添加氨基酸对腐食酪螨(替代猎物)和巴氏新小绥螨发育进度、繁殖力、抗逆性、捕食功能等均有影响。鉴于此,本论文研究了亮氨酸、组氨酸2种氨基酸添加对巴氏新小绥螨的抗逆性及捕食功能的影响,进一步构建了巴氏新小绥螨的转录组测序文库,并进行了转录组测序,对未添加与添加亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨间显差异表达基因进行了分析,最后对巴氏新小绥螨体内3个热激蛋白基因(Heat shock proteins,Hsps)进行序列分析,并对其诱导表达模式进行了研究。本研究结果对巴氏新小绥螨规模化、高效人工繁殖及提高其田间适应性及防治效果有一定的指导意义,也可为了解Hsps在巴氏新小绥螨抗高温逆境胁迫中的分子机制,为天敌的分子改造提供理论基础。主要研究结论如下:
  1.氨基酸营养添加能延长巴氏新小绥螨的耐饥时间、提高巴氏新小绥螨的耐高温能力以及捕食能力。在25℃饲养环境中,巴氏新小绥螨雌成螨喂养腐食酪螨的条件下,其群体存活率为50%时,添加亮氨酸的饲养组耐饥时间最长,添加组氨酸的饲养组次之,未添加氨基酸的对照组耐饥时间最短,说明添加氨基酸能延长巴氏新小绥螨的耐饥时间;在40℃高温下处理10h,经亮氨酸和组氨酸饲养的巴氏新小绥螨的存活率相比未添加氨基酸对照组分别提高了56.00%和26.00%,说明添加氨基酸能够提高巴氏新小绥螨的耐高温能力;添加氨基酸饲养后的巴氏新小绥螨的捕食能力和最大日捕食量都有一定的变化,其中相比于未经氨基酸添加饲养的对照组,亮氨酸、组氨酸添加饲养后的巴氏新小绥螨的捕食能力有所提高,亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨捕食能力相对提高了17.08%,组氨酸饲养的巴氏新小绥螨的捕食能力相对提高了31.82%。添加氨基酸饲养的巴氏新小绥螨对腐食酪螨的捕食功能反应曲线均为典型的无脊椎动物凸型曲线,即HollingⅡ型。
  2.利用高通量测序技术对未添加氨基酸饲养的巴氏新小绥螨与添加亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨分别进行转录组测序,使用Trinity软件,将测序结果reads进行无参测序数据拼接,拼接获得巴氏新小绥螨的转录组Unigene,并对Unigene进行功能注释和GO、KEGG等蛋白质功能分类和代谢途径分析。结果表明:未添加氨基酸饲养的巴氏新小绥螨转录组共获得52817486对raw data reads共7.92G的测序总量。Trinity拼接结果获得23893个基因,86422个转录本,将拼接获得23893个gene使用BLAST方法进行基因功能注释后,其中有7260个注释到Swiss-Prot库,13386个注释到NR库,7567个注释到Pfam库,6078个注释到KEGG库,7420注释到KOG库,6604注释到GO库。添加亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨转录组共获得64516490对raw datareads共9.68G的测序总量。Trinity拼接结果获得34480个基因,57021个转录本,将拼接获得34480个gene使用BLAST方法进行基因功能注释后,其中有10509个注释到Swiss-Prot库,18556个注释到NR库,11230个注释到Pfam库,8499个注释到KEGG库,10735注释到KOG库,9664注释到GO库。
  未添加氨基酸饲养与添加亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨相比,显著性差异表达的基因共有1291个,其中上调显著性差异表达的基因有376个,例如囊泡相关膜蛋白(vesicle-associated membrane protein1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme E2L3)、天冬氨酰-tRNA合成酶(asparaginyl-tRNA synthetase)等。大多数的差异表达的基因都是下调表达(915个),例如热休克蛋白(heat shock protein)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase)以及小亚基核糖体蛋白(small subunit ribosomal protein S19e)等。本研究对巴氏新小绥螨进行转录组研究,获得大量的基因数据,为从基因分子水平更深层次研究环境条件对巴氏新小绥螨影响提供支持。
  3.在巴氏新小绥螨转录组数据库中鉴定出Hsps基因,共获得21个unigene,热激蛋白基因家族包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40及小Hsp家族。Hsp90家族有10条、Hsp70家族有7条、Hsp60家族有2条、Hsp40家族及小Hsp家族各有1条。NbHsp90的开放阅读框为2142bp,编码713个氨基酸,预测相对分子量为81.9kDa,等电点为5.08;NbHsp60的开放阅读框为1755bp,编码583个氨基酸,预测相对分子量为62.2kDa,等电点为5.55;NbHsp40的开放阅读框为1206bp,编码401个氨基酸,预测相对分子量为44.7kDa,等电点为6.21。与其它物种中已知的Hsps氨基酸序列进行相似性分析显示巴氏新小绥螨热激蛋白基因与西方盲走螨(Metaseiulus occidentalis)和其它昆虫相应的氨基酸序列具有高度相似性。
  4.利用荧光定量PCR技术,分别分析了不同温度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及43℃处理下,未添加氨基酸饲养的巴氏新小绥螨与添加亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨雌成螨体内NbHsp90、NbHsp60、NbHsp40三个基因的表达情况。结果表明,25℃恒温条件下,未添加氨基酸饲养的巴氏新小绥螨NbHsp90、NbHsp60、NbHsp40的表达量较低,高温(30℃、35℃、40℃、43℃)及低温(15℃、20℃)均可诱导NbHsp90、NbHsp60、NbHsp40表达量上升。添加亮氨酸饲养的巴氏新小绥螨3个NbHsps基因均能被高温、低温胁迫所诱导;在30℃时,NbLeuHsp40、NbLeuHsp60、NbLeuHsp90表达量较高。
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