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[硕士论文] 楚红蕾
免疫学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:固有免疫是机体免疫系统防御微生物感染的第一道防线。激活固有免疫需要模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别微生物病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)后,在机体内形成相应信号转导,最终引起免疫应答。YIPF5是YIP家族蛋白成员之一,定位于内质网、ERGIC、顺面高尔基体上。研究表明YIP家族蛋白成员能与Rab GTPase结合,参与调节内质网与高尔基之间的囊泡运输。作为YIP家族蛋白中的一员,YIPF5与内质网上COPⅡ被膜小泡的生成过程有关,可以随COPⅡ小泡由内质网转移至顺面高尔基体上。STING是调控Ⅰ型干扰素基因表达的重要信号分子,在感受胞质DNA和免疫防御方面起着重要的信号传递作用,研究表明STING所介导的信号通路的活化依赖于它在细胞内的转位,当机体感染DNA病毒后,STING从内质网经过高尔基体转移至核外周小体上,进而活化下游信号通路,促进Ⅰ型干扰素的产生。YIPF5参与了胞内囊泡运输,并且影响从内质网到高尔基体的转运过程,但YIPF5是否参与机体的天然免疫反应以及STING的转位仍然未知。因此本论文探索了YIPF5是否通过影响STING功能进而调控天然免疫抗病毒反应。在本文中,发现用siRNA干扰小鼠腹腔巨噬细胞中YIPF5的表达后,ISD、LPS、SeV诱导的Ⅰ型干扰素IFN-β和炎性细胞因子TNF-α、IL-6等表达下调,干扰素调节因子IRF3和激酶TBK1的磷酸化都明显下调;在感染VSV病毒后,巨噬细胞的抗病毒能力同样下降。同时YIPF5影响STING在核周的聚集,说明YIPF5可能通过影响STING的转位调节机体天然免疫反应。
  研究目的:
  探讨YIPF5在抗病毒天然免疫中的作用,YIPF5是否通过STING影向天然免疫信号通路。
  研究方法:
  1)敲低YIPF5的表达是否影响天然免疫信号通路中不同细胞因子的表达
  获得小鼠原代腹腔巨噬细胞,转染YIPF5siRNA48h后,分别转染ISD3h、6h、9h;LPS刺激2h、4h、6h;感染SeV4h、8h、12h,提取细胞总RNA,将RNA反转录成cDNA后,用qRT-PCR在mRNA水平上检测不同信号通路下游细胞因子IFN-β,TNF-α,IL-6,Ccl5和Cxcll0在mRNA水平表达的变化。
  2)敲低YIPF5的表达是否影响天然免疫信号通路中IRF3和TBK1磷酸化
  获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,向巨噬细胞中转染siYIPF5为实验组,同时以siCtrl做对照组。48h后转染ISD1h、2h、4h;LPS刺激0.5h、lh、2h;感染SeV2h、4h、6h,提取细胞总蛋白,用Western Blot在蛋白水平上检测IRF3和TBK1磷酸化水平的变化。
  3)敲低YIPF5的表达是否影响巨噬细胞抗病毒能力
  获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,转染siYIPF5,同时以siCtrl做对照组。用VSV-GFP感染4h、8h、12h,保留细胞上清培养液,用试剂盒提取细胞总RNA,反转录为cDNA后,用qRT-PCR在mRNA水平上检测IFN-β、VSVmRNA的表达;收集细胞培养液上清,在HEK293细胞中用病毒空斑实验检测病毒滴度;转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达,用VSV-GFP感染4h、6h,提取细胞总蛋白,检测细胞内VSV-G在蛋白水平的变化。
  4)YIPF5是否影响STING的聚集
  获得小鼠原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达后,转染ISD刺激细胞内STING发生转位,使STING活化聚集成大的复合物,通过免疫荧光染色在荧光显微镜下观察STING的聚集状态。
  构建YIPF5过表达载体,在Hela细胞中过表达YIPF5,以Vector为对照,同时转染STING-GFP,在荧光显微镜下观察STING-GFP的表达是否受影响。
  在Hela细胞中转染siCtrl或siYIPF524小时后,转染STING-GFP,24小时后在荧光显微镜下观察STING-GFP在核周的聚集状态。
  5)YIPF5是否与STING相互作用
  在Hela细胞中过表达STING-Myc,同时梯度过表达YIPF5-Myc,用Western Blot检测STING和STING-Myc在蛋白水平上的表达变化。
  在Hela细胞中过表达YIPF5,以Vector为对照,同时转染STING-GFP,24h后转染ISD激活STING使其转位发生二聚化,免疫荧光染色YIPF5,在荧光显微镜下观察STING与YIPF5是否存在共定位现象。
  获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,转染ISD2h、4h后,用免疫共沉淀检测内源性YIPF5和STING的是否直接结合。
  研究结果:
  1)敲低YIPF5的表达下调天然免疫信号通路中多种细胞因子的表达
  在小鼠原代腹腔巨噬细胞中用小干扰RNA敲低YIPF5的表达后,转染ISD或感染LPS/SeV,激活细胞内多条免疫信号通路,用qRT-PCR检测多种下游细胞因子在mRNA水平的变化,发现敲低YIPF5的表达后,细胞内IFN-βmRNA水平表达下降,IFN-β相关基因Ccl5和Cxcl10在mRNA水平上表达下降;促炎因子TNF-α,IL-6mRNA水平表达下降。
  2)敲低YIPF5的表达下调天然免疫信号通路中IRF-3和TBK1磷酸化水平
  转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达,转染ISD或用LPS、SeV感染不同时间段之后,Western Blot检测结果显示转录因子IRF3、激酶TBK1在蛋白磷酸化水平均有明显下降趋势。
  3)敲低YIPF5的表达使巨噬细胞抗病毒能力减弱
  用VSV验证了YIPF5的抗病毒作用,发现敲低YIPF5表达后,VSV感染小鼠巨噬细胞引起细胞内IFN-βmRNA表达下降,而VSV mRNA水平表达上升,同时病毒空斑实验也发现YIPF5表达下降使VSV病毒滴度升高;VSV-G在蛋白水平表达上升。
  4)YIPF5影响STING的聚集
  在转染siRNA敲低小鼠原代腹腔巨噬细胞中YIPF5的表达后,转染ISD使STING活化,发生转位和聚集,然后对STING进行免疫荧光染色,在显微镜下观察STING的表达和聚集情况,发现在不给予ISD刺激时,实验组荧光强度相较于对照组较弱;在ISD激活STING后,实验组荧光强度相较于对照组则明显减弱;
  在Hela细胞中共转染STING-GFP和YIPF5-Myc,同时转染Vector做阴性对照,24h后收细胞做免疫荧光染色,发现过表达YIPF5对STING的聚集现象没有明显增强作用。
  在Hela细胞中转染siCtrl或siYIPF524小时后,转染STING-GFP,24小时后在荧光显微镜下观察STING-GFP在核周的聚集状态,发现对照组STING-GFP明显在核周聚集,而实验组相对分散。
  5)YIPF5与STING没有直接结合
  在Hela细胞中转染STING-GFP,同时梯度共转染YIPF5-Myc,24h后Western Blot检测发现细胞内STING和STING-Myc在蛋白水平没有明显变化。
  在Hela细胞中共转染STING-GFP和YIPF-Myc,24h后转染ISD使STING活化聚集,4h后收细胞做免疫荧光染色。在荧光显微镜下观察后,发现STING和YIPF5没有共定位现象。
  同时在小鼠原代腹腔巨噬细胞中转染ISD使STING活化,收细胞蛋白,用Co-IP检测STING与YIPF5在巨噬细胞内是否存在内源性结合,结果显示二者也没有直接结合。
  研究结论:
  1)YIPF5在抗病毒天然免疫中发挥作用,敲低YIPF5的表达影响IRF3和激酶TBK1的磷酸化,进而影响免疫应答下游多种细胞因子的表达。
  2)敲低YIPF5的表达会影响STING转位聚集,但YIPF5不影响STING的表达,而且YIPF5与STING没有直接相互作用。YIPF5调控STING转位的精确调控机制还需要进一步研究。
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