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[硕士论文] 梅晶晶
生物化学与分子生物学 南京师范大学 2006(学位年度)
摘要:人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)是一种B淋巴细胞的共刺激因子,属TNF超家族成员。本文一方面利用巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)这一真核表达系统成功构建、表达了hBAFF蛋白;同时对毕赤酵母分泌表达得到的hBAFF进行SDS-PAGE、Western blotting、ELISA等方面的检测。另一方面将hBAFF基因通过柔性臂(Gly<,4>Ser)<,2>与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)相连,通过大肠杆菌(E.coli)表达系统进行融合蛋白的表达;并对表达蛋白做Western blotting、荧光及B淋巴细胞增殖的活性测定。实验设计及结果如下: 1 EGFP-hBAFF融合蛋白的表达纯化及活性测定 将人B淋巴细胞刺激因子和增强型绿色荧光蛋白通过(Gly<,4>Ser)<,2>linker相连接,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白EGFP-hBAFF;并对该蛋白进行Ni<'2+>-IDA亲和层析柱纯化,纯化的蛋白经检测具有EGFP的荧光活性和hBAFF的B淋巴细胞增殖活性。 2 hBAFF在毕赤酵母中的表达及产物鉴定 克隆得到hBAFF基因与穿梭载体pPIC9连接得到pPIC9-hBAFF重组质粒,线性化后电转酵母菌GSll5中,挑选出阳性重组子进行诱导表达;并对表达条件优化,表达产物进行Western blotting、ELISA方面的检测。结果表明,当甲醇浓度为1%、诱导时间为72h、温度为20℃时hBAFF蛋白表达量最高。
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