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[硕士论文] 柏雪梅
生理学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)导致的缺氧缺血性脑损害(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是临床上导致新生儿死亡以及长期神经功能缺陷的常见疾病。目前临床上针对该病的治疗主要是营养支持、对症治疗,然而疗效并不理想。因此,寻找更为有效的治疗方法和靶点成为当前迫切需要解决的问题。
  研究表明,Shh信号通路跨膜蛋白受体Smo的激动剂2,6,9-三取代嘌呤化合物(Purmorphamine,PUR)在急性脑卒中模型中具有神经保护作用。PUR作为Smo受体的小分子激动剂通过直接结合并激活Smo进而激活Shh通路。我们新近研究证实,PUR在大鼠蛛网膜下腔出血模型中具有神经保护作用。同时,研究证实PUR可以通过血脑屏障,在神经系统发挥抗炎作用。目前对于PUR是否在HIBD中发挥作用以及发挥何种作用,还没有报道。因此,基于PUR在神经方面的保护作用,我们对PUR在HIBD后的神经损伤中的作用和机制进行初步探讨。
  研究目的:
  本课题采用Rice-Vannucci法建立HIBD模型来研究PUR在新生小鼠HIBD后神经损伤中的作用及机制。
  研究方法:
  采用Rice-Vannucci法建立HIBD模型以模拟人类新生儿HIBD。
  1.建立HIBD模型:购买并饲养C57BL/6J孕鼠,待其生产后饲养至第七天,选择出后7天(postnatal day,PND7)的雄性乳鼠来建立HIBD模型。给予胸小鼠2%-2.5%的异氟烷麻醉后,分离并结扎右侧颈总动脉;经过低氧(8% O2+92% N2)处理90分钟(90 min)后,可产生类似于人类新生儿HIBD的病理生理改变,主要表现为损伤侧脑组织的大脑皮层、海马、深部灰质以及脑室周围的白质出现明显的水肿现象。
  2.实验分组及干预方法:PND7乳鼠被随机分为五组:假手术组(Sham组),缺氧缺血(Hypoxic-ischemic,HI)性脑损伤组(HI组),HI+PUR干预组(HI+PUR组),HI+PUR+环巴胺(Cyclopamine,Cyc)即(HI+PUR+Cyc组),和HI+Cyc组(HI+Cyc组)。将Sham组、HI组、HI+PUR组、HI+PUR+Cyc组、HI+Cyc组,按时间点分别在HIBD模型建立后24 h,48 h,72 h给予等量的生理盐水,PUR(10 ml/kg)和Cyc(0.5 ml/kg)腹腔注射。
  3.检测方法:(1)新生小鼠HIBD后72 h取材,用以检测PUR在HIBD急性期的作用。(2)新生小鼠HIBD后14d(PND21),利用旷场实验检测PUR对小鼠自主行为活动的影响。(3)新生小鼠HIBD后28 d(PND35),利用水迷宫实验检测PUR对小鼠HIBD后远期学习和记忆的影响。(4)系统性的研究PUR对HIBD的神经保护作用及其分子机制:如利用Western blot和RT-PCR技术来检测PUR对脑缺氧缺血性损伤皮层中Shh通路信号分子Shh、Ptch和Gli-1水平,以及凋亡指标Bax、Bcl-2等的影响;利用免疫荧光技术和免疫组化检测PUR对神经元凋亡以及HIBD后氧化应激的影响;利用透射电子显微镜(Transmission electronmicroscope,TEM)技术从超微结构上检测PUR对HIBD后神经元的影响。
  研究结果:
  1.脑组织含水量变化:与Sham组相比,HI组损伤侧(右侧)脑组织含水量升高(p<0.001);HI+PUR组右侧脑组织水含量较HI组明显减少(p<0.001),HI+PUR+Cyc组右侧脑组织含水量较PUR组显著升高(p<0.05)逆转了PUR减轻脑水肿的作用;而对侧脑组织(左侧)的含水量无明显变化。
  2.脑组织TTC染色观察各组脑组织梗死面积:与Sham组相比,HI组脑组织可见明显的脑梗死区域;而PUR显著抑制了HIBD诱导的脑梗死现象(p<0.001),降低脑梗死面积;而Cyc逆转了PUR的这一作用。
  3.脑Nissl染色结果显示:Sham组右侧脑组织结构清晰完整;与Sham组相比,HI组右侧大脑皮层和海马损伤明显,组织丢失严重(p<0.001);HI+PUR组右侧脑组织较HI组显著改善(p<0.001);与HI+PUR组相比,HI+PUR+Cyc组右侧组织损伤严重(p<0.05),Cyc逆转了PUR的保护作用。
  4.PUR对新生小鼠HIBD后72 h神经元超微结构的影响:Sham组神经元结构完整,形态正常,核膜连续,细胞器形态正常;与Sham组相比,HI组神经元出现严重的超微结构损伤,细胞质出现明显的空泡化,细胞核形态不规则,核膜模糊或不连续,线粒体和内质网水肿,结构紊乱;与HI组相比,PUR显著抑制HIBD诱导的神经元损伤。
  5.新生小鼠HIBD后72 h小鼠右侧皮层神经元凋亡指标检测结果:(1)Westernblot结果显示:与Sham组相比,HI组Bax/Bcl-2(p<0.001)比率和Cleavedcaspase-3(p<0.001)显著上调;与HI组相比,HI+PUR组的Bax/Bcl-2比率(p<0.01)和Cleaved caspase-3(p<0.001)显著下调,PUR显著抑制了HIBD诱导的Bax/Bcl-2比率升高和caspase-3的活化。(2) RT-PCR结果显示:与Sham组相比,HI组Bax/Bcl-2比率显著上调(p<0.001);与HI组相比,HI+PUR组的Bax/Bcl-2比率显著下调(p<0.01);PUR显著抑制HIBD后Bax/Bcl-2比率。(3)TUNEL检测结果显示:与Sham组相比,HI组右侧脑组织的TUNEL阳性细胞显著增多(p<0.001);与HI组相比,HI+PUR组TUNEL阳性细胞显著降低(p<0.001)。(4) Cleaved caspase-3/Neun免疫荧光染色结果显示:HI组Cleavedcaspase-3/Neun阳性细胞数量明显高于Sham组(p<0.001);而与HI组相比,HI+PUR组Cleaved caspase-3/Neun阳性细胞数量显著减少(p<0.001),PUR显著抑制了HIBD诱导的caspase-3活化。而Cyc干预后逆转了PUR的以上作用。
  6.新生小鼠HIBD后72 h右侧皮层cAMP应答元件结合蛋白(cAMP responseelement binding protein,CREB)-脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophicfactor,BDNF)表达水平的改变:与Sham组相比,HI组中的BDNF和磷酸化CREB(Phospho-CREB,p-CREB)表达显著下调(p<0.01);与HI组相比,HI+PUR组的BDNF(p<0.001)和p-CREB(p<0.05)显著上调,PUR显著抑制HIBD诱导的CREB去磷酸化现象。
  7.PUR对新生小鼠HIBD后72 h右侧皮层AKT/p-Akt表达水平的影响:HI组中p-Akt的水平较Sham组显著下调(p<0.001);与HI组相比,HI+PUR组逆转了HIBD诱导的AKT急性去磷酸化现象(p<0.01),而Cyc逆转了PUR的这一作用。
  8.新生小鼠HIBD后72h右侧皮层中ROS水平检测结果显示:与Sham组相比,HI组ROS水平显著上调(p<0.01);而HI+PUR组较HI组ROS水平明显下调;HI+PUR+Cyc组ROS水平则明显高于HI+PUR组(p<0.01),Cyc逆转了PUR下调ROS的作用。
  研究结论:
  我们的研究结果表明:在新生小鼠HIBD模型中,PUR激活Shh信号通路,上调信号分子Shh、Ptch和Gli-1的表达,在HIBD后发挥神经保护作用。PUR在HIBD急性期脑损伤以及长期神经损伤中具有保护作用。在急性期,PUR可以减轻脑水肿,减少脑梗死面积,下调凋亡指标(Cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值)的表达,降低损伤侧大脑皮层中ROS的水平和上调Nrf-2继而减弱氧化应激以及促进神经元修复。在长期脑损伤中,PUR可以改善HIBD损伤侧脑的梗死情况,改善神经功能,促进HIBD后远期学习和记忆功能的恢复。
  短期应用PUR对于治疗新生小鼠中HIBD有着巨大的潜力。PUR在HIBD中特异且敏感地靶向激活Shh信号通路,促进HIBD后神经功能恢复,有望成为治疗新生儿HIBD的辅助药物,同时为临床治疗新生儿缺氧缺血性疾病提供新思路。
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