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摘要:[目的]证实大肠杆菌Nissle 1917作为自然菌株存在于动物猪体内,并能从猪粪便中分离.建立大肠杆菌Nissle 1917的原位杂交鉴定方法.[方法]采集135份健康断奶仔猪的新鲜粪便制备DNA模板,以人源大肠杆菌Nissle 1917为阳性对照菌株,分别针对Nissle 1917的Ⅰ型菌毛亚单位FimA、F1C菌毛亚单位FocA及两个质粒pMUT1和pMUT2的相关基因序列设计5对特异性引物进行PCR扩增;并将其中427 bp大小的质粒片段pMUT2(a)作为目的片段回收纯化,用地高辛随机引物标记法制成DNA探针.[结果]从其中的2份DNA模板中扩增出上述5对特异性引物PCR预期大小相符的片段,初步认为大肠杆菌Nissle 1917可能存在于猪体内.应用制备的探针通过菌落原位杂交的方法从2份阳性粪便样品中筛选出2株阳性菌落,通过血清学检验、PCR扩增和测序进一步鉴定为阳性Nissle 1917菌株.[结论]动物源益生菌Nissle 1917的分离鉴定,为优良动物源益生菌研究和应用奠定了基础....
摘要:牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)有两种基因型:基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2).以往的流行病学调查显示BVDG1的分布和流行区域更加广泛,但近年来国内BVDV-2的发病率呈持续升高趋势.BVDV-2通常会引起严重的急性感染和出血综合征,给养牛业造成巨大损失.本文就BVDV-2特异性检测方法和基因分型的建立,型特异性BVDV-2毒株的分离与鉴定,BVDV-2优势分离株的全基因组测定与遗传特性分析及BVDV-1和BVDV-2抗原和抗体检测平台的建立等方面展开简要综述....
摘要:质粒消除旨在获得无质粒菌株,是对益生菌进行遗传改造所需的一项重要技术.本试验建立在质粒不相容性的基础上,引入自杀性载体pRE112作为辅助工具,使用分子生物学方法构建重组自杀质粒pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,将其分别导入携带2个大隐秘质粒pMUT1和pMUT2的益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Escherich-ia coli Nissle 1917,EcN),利用重组自杀质粒去除EcN内原有隐秘质粒并在含有10%蔗糖的LB培养基上实施自杀质粒自身消除.结果试验成功获得EcN无质粒克隆菌株(Escherichia coli Nissle 1917 cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2,EcNc).为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定基础....
摘要:为探索大肠杆菌Nissle 1917株(EcN)鞭毛展示的应用,本研究以重组质粒pUC 18-fliC为模板,反向PCR产物经Dpn Ⅰ、ExnaseTMⅡ重组环化,将6His标签基因分别插入无质粒大肠杆菌Nissle 1917 (EcNcured of its two cryptic plasmids pMUT1和pMUT2;EcNc) fliC高变区774 bp~775bp和792 bp~S1t bp之间,构建嵌合鞭毛基因片段fliC01和fliC02.分别将其克隆于自杀性载体pRE112中,构建重组质粒pRE112-fliC01和pRE112-fliC02,并分别转化至EcNc中.通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合于EcNc基因组中,构建无抗性筛选的重组菌株EcNc fliC01和EcNc fliC02 .对重组菌株进行生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验检测,结果表明EcNc fliC01和EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛能够被H1多抗或His-Tag单克隆抗体识别并组装形成鞭毛丝;重组菌对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与亲本株EcNc相比无显著性差异.本实验结果为进一步研究EcNc鞭毛展示技术应用于活疫苗研制奠定了基础....
[期刊论文] 杨颖 朱军 朱国强
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北大核心 CSTPCD CA
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摘要:初步研究大肠杆菌Nissle 1917(E. coli Nissle 1917,EcN)鞭毛蛋白(Flagellin, FliC)高变区的功能,为探讨其作为表面展示系统的可行性打下基础。以EcN无质粒克隆(EcN was cured of its 2 cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2 resulting in EcNc)为实验菌株,分别构建2个鞭毛蛋白基因(fliC)高变区859-888位、829-858位的缺失突变株和回补菌株。分析突变区域对EcNc的生长性能、生化特性、运动性及抗原性等方面的影响。结果显示:EcNc、两个缺失株和回补株的生长特性无明显差异,且三者生化试验结果一致。缺失突变株在半固体培养基上不能运动,而回补株均恢复了原运动性;缺失突变株均不与H1单因子血清发生凝集,而互补菌株均能产生与EcNc一致的凝集反应。表明高变区的这两个区域尽管不影响菌株的生长性能和生化特性,但与EcN的运动性及抗原性密切相关。这为进一步探索EcN鞭毛展示技术的研究提供了一定的数据。...
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:为了解猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与牛源BVDV在遗传特性上的差异,本试验对实验室分离保存的1株猪源BVDV(SH-28)进行了全基因组测序.利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了SH-28分离株的18条cDNA片段,分别克隆于pGEM-T质粒载体并进行测序,用CLUSTX(1.8)和Lasergene软件进行序列的剪切和拼接,最终获得SH-28基因组序列全长为12 279个核苷酸(nt),开放阅读框(ORF)长11 685 nt,编码3 895个氨基酸(aa),5'-UTR和3’-UTR分别长385 nt和206 nt.全基因组进化树结果表明,虽然SH-28与HLJ-10同处于一个分支上,但其与XJ-04的全基因组核苷酸同源性最高(92.3%),而与另外2株猪源BVDV-1(ZM-95、SD0806)的亲缘性较远(70.0%、70.1%).5’-UTR进化树结果显示,SH-28分离株属于BVDV-2a2基因亚型,而HLJ-10和J-04株属于BVDV-2a1.由此,我们推测SH-28很有可能是由牛源BVDV-2进化而来的,但不同于已发表的BVDV-2分离株....
摘要:对氨基苯酚是重要的精细化工原料.本研究提出连续化水解、加氢合成对氨基苯酚的工艺,并开发一种新型的碳基Ni加氢催化剂.实验结果表明,催化剂的有效使用寿命大于1000hr,当水解温度为:166~168℃,加氢压力:8.0 kg/cm,温度:95~100℃时,各工艺段的转化率和选择性均高于99%.本研究开发了连续化水解、加氢合成对氨基苯酚的新工艺,流程简洁,原料利用率高,易于实现工业化....
摘要:扬州八怪元素在当代成为了文创衍品的创意来源.本文对扬州八怪艺术元素与其在文创衍品的开发之中的启发与应用进行分析,认为扬州八怪艺术元素在文创衍品设计中的应用可以同时提升产品的文化内涵与扬州历史名城形象,也为其他类型城市的文创产业发展与城市形象打造提供新思路....
摘要:对于中国传统画坛而言,"以书入画"的观念具有深远的影响,这一观念在八大山人的艺术创作之中有明显体现.八大山人对书法与绘画之间的联系感悟较深,并且将两种类型的艺术互相渗透.这对其艺术风格的形成产生了深远影响,并帮助他在书画两种艺术领域均取得了卓越的成就.该文研究八大山人的书法与绘画创作,通过"以书入画"观念分析八大山人的书法与其绘画之间的联系,以期为当代艺术家的书画创作提供参考....
摘要:文章首先阐述了芬兰的"教师教育发展规划",其次分析了我国中小学教师培养现状,最后指出了芬兰教师教育对我国中小学教师培养的启示,即建立严格的教师招生体系,加强各方合作联系,培养研究型教师,改变一任终身的体制....
[专利] 发明专利 CN201811422062.6
扬州大学 2019-03-22
摘要:本发明涉及到生物技术领域,具体涉及整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用,包括如下步骤:pTargetT‑X::PtetF18重组质粒的构建;通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建,得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株且表达展示在细胞表面。相对于现有技术,本发明的有益效果为:去除Nissle1917益生菌原有质粒,无抗性基因的存在;该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞(IPEC‑1)的粘附性能;口服免疫小鼠能产生免疫血清,即抗F18菌毛的IgG的抗体;口服免疫后小鼠血清能显著减低F18+菌株对猪肠道传代细胞系IPEC‑J2的粘附。
[专利] 发明专利 CN201811422515.5
扬州大学 2019-03-15
摘要:本发明涉及到生物技术领域,具体涉及整合四拷贝F18菌毛操纵子基因和双拷贝F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法,包括如下步骤:pTargetT‑X::PtetF18和pTargetT‑X::PtetF4重组质粒的构建;通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因和双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建,得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因和双拷贝F4菌毛基因复合整合克隆株。本发明的有益效果为:该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞的粘附性能;口服免疫小鼠能产生免疫血清,即抗F18菌毛和抗F4菌毛的IgG的抗体;口服免疫后小鼠的血清能显著减低F18+和F4+菌株对猪肠道传代细胞系IPEC‑J2的粘附。
[专利] 发明专利 CN201811421935.1
扬州大学 2019-03-15
摘要:本发明涉及到生物技术领域,具体涉及整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用,包括如下步骤:pTargetT‑nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建;通过整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建,得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。该益生菌克隆株作为益生菌活疫苗候选株和仔猪断奶后腹泻和水肿病的治疗用药物。相对于现有技术,本发明的有益效果为:去除Nissle1917益生菌原有质粒,无抗性基因的存在;该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞的粘附性能;口服免疫小鼠能产生免疫血清,即抗F4菌毛的IgG的抗体;口服免疫后小鼠的血清能显著减低F4+菌株对猪肠道传代细胞系的粘附。
摘要:经营者违反安全保障义务的侵权责任是指负有安全保障义务的人违反该义务,直接或间接地导致他人人身和财产损害,从而应该承担的损害赔偿责任.在实践中,应该明确责任主体和保护对象,用过错推定的原则来确定经营者的责任,在第三人侵权的情况下,也应该根据过错大小要求经营者承担相应的责任....
摘要:当下死亡赔偿金数额的差异招致了学界和群众的普遍批评,因此引发了各界对“同命不同价”的激烈辩论.关于死亡赔偿金的赔偿标准应该在确定其性质的情况下,再在充分考虑受害人职业、年龄、收入状况的情况下,确立有差异的赔偿数额...
[博士论文] 杨颖
预防兽医学 扬州大学 2016(学位年度)
摘要:大肠杆菌Nissle1917(Escherichia coli Nissle1917; EcN)是德国医生Alfred Nissle于1917年从一名抗腹泻士兵粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区疾病的侵扰。随后,在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为人用药Mutaflor(@)的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来,EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多,其内含的pMUT2、Ⅰ型分泌系统以及Ⅴ型分泌系统等皆用于将外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示属于细菌表面展示技术之一,其基于鞭毛蛋白的高变区可容纳外源多肽且组装成鞭毛丝进而实现外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技术较多在报道沙门氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鉴于EcN是强大效能益生菌,本研究首先构建了EcN无质粒克隆菌株EcNc(EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc),以其鞭毛蛋白高变区为切入点来探讨EcNc鞭毛表面展示。
  EcN中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒,且2个质粒在传代中很稳定,不易丢失;pMUT1带有ColE1类型复制系统,pMUT2含有类ColE2复制系统,然而对这2个隐秘大质粒的生物学意义了解较少。有研究报道大肠杆菌的致病性受到质粒的调控,且部分大肠杆菌菌株的抗性基因也可能与其隐秘质粒有关。为减少上述隐秘质粒对外源性重组质粒转化和基因组DNA操作带来的不便,同时考虑EcN作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的副作用,本试验使用限制性内切酶SphⅠ将携带sacB的自杀性质粒载体pRE112分别与隐秘质粒pMUT1、pMUT2连接,构建重组质粒载体pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,进一步应用竞争性抑制分别去除EcN自身携带的隐秘质粒,基于自杀性质粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培养基平板上实施自杀质粒自身消除,最后获得EcN无质粒克隆菌株即EcNΔpMUT1ΔpMUT2,命名为EcNc(EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)。对无质粒菌株EcNc生长状况、生化试验、电镜观察以及体外细胞黏附检测,试验结果表明去除两个隐秘大质粒后的EcNc,其生长、生化特性、血清学、形态学特征、体外细胞黏附与原型EcN一致,利用获得的EcNc菌株,将更加方便质粒的转化和遗传相关生物学操作。
  基于编码EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用九噬菌体Red同源重组系统对EcNc菌株的fliC基因进行敲除。首先纯化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表达盒的PCR扩增产物,电转化至已携带pKD46质粒的EcNc菌株中,在Red同源重组酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通过两翼同源序列与染色体对应靶基因序列同源重组,在氯霉素抗性平板上筛选到一次同源重组菌株EcNcΔfliC∷cat。再将质粒pCP20电转化EcNcΔfliC∷cat菌株,通过其在42℃表达的Flp重组酶消除PCR片段中FRT位点之间的氯霉素抗性基因。经过PCR鉴定和DNA测序证明二次重组菌,即fliC缺失菌株EcNcΔfliC构建成功。将pBR322-fliC电转化EcNcΔfliC构建了回补菌株EcNcΔfliC/pBR322-fliC。同时,以构建好的pUC18-fliC重组质粒为模板,通过反向PCR分别构建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,双酶切后连接到自杀载体pRE112中,构建重组自杀载体pRE112-fliC1、pRE112-fliC2,将其分别导入EcNc菌株中,通过一次重组、二次重组及DNA测序筛选到EcNc鞭毛蛋白基因部分高变区缺失的菌株EcNc fliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNcΔfliC、 EcNcΔfliC/pBR322-fliC、EcNcfliC1、EcNc fliC2的成功构建,旨在进一步探索鞭毛蛋白高变区序列改变对EcNc性状的影响。
  测试EcNc、EcNcΔfliC、EcNcΔfliC/pBR322 fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生长性能、运动性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及体外细胞黏附、体内肠道定植能力。结果显示,各株细菌生化特性一致,生长性能没有差异变化;EcNcΔfliC在半固体培养基上无运动性能,Western blot检测不到鞭毛蛋白的表达,且电镜下观察不到鞭毛形态,其对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则下降64%(p=0.002)、相对于EcNc fliC1下降52%(p=0.018)、相对于EcNc fliC2下降50%(p=0.01)。EcNcΔfliC回补菌株EcNcΔfliC/pBR322-fliC与EcNc的特性相一致,对IPEC-J2的黏附能力恢复到EcNc的黏附水平;用Western blot能检测到EcNc fliC1、EcNcfliC2鞭毛蛋白的表达,电镜下亦能观察到鞭毛丝,但它们在半固体培养基上几乎不能运动,EcNc fliC1、EcNcfliC2对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则分别下降26%(p=0.124),29%(p=0.586),差异不显著;但EcNc fliC1对IPEC-J2的黏附能力比EcNcΔfliC高52%(p=0.018),EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力比EcNcΔfliC高50%(p=0.01)。在体内肠道定植试验中,接种后第1d、第3d、第7d取样检测,各组细菌在同一肠段(回肠、盲肠或结肠)的定植能力无显著差异;但各组细菌在盲肠的定植数量高于各自在回肠和结肠的定植,尤其是接种后第1 d,EcNc/pBR322、EcNcΔfliC/pBR322-fliC、 EcNc fliC1/pBR322、EcNc fliC2/pBR322在盲肠的定植显著高于其各自在回肠的定植数量。EcNc还具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他们也共同介导和促进细菌在动物体内的定植,使得EcNcΔfliC/pBR322也能在小鼠肠道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高变区分别缺失287-296位或者277-286位10个氨基酸后亦能表达鞭毛蛋白并形成鞭毛丝,且不影响重组菌在小鼠体内的定植能力,说明EcNc鞭毛蛋白高变区能容许部分氨基酸的缺失。
  随后本研究尝试以鞭毛基因高变区表面展示外源基因。以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对含六聚组氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物,反向PCR产物经DpnⅠ、ExnaseTMⅡ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliC01、fliC02)的重组质粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02,fliC01、fliC02这两个片段为将六聚组氨酸肽(6His)基因分别插入EcNc fliC高变区774-775位和792-811位碱基之间的序列。将fliC01、fliC02片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,最终获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。对重组菌株生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验分析,结果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag单抗识别并且能组装形成鞭毛丝;EcNcfliC01、EcNc fliC02对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与EcNc相比无显著性差异。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能将其展呈于菌体表面。
  在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对分别含有BVDV(Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T细胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR产物经DpnⅠ、ExnaseTMⅡ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重组质粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT,fliCB、fliCT片段为将B细胞表位、T细胞表位基因分别插入fliC基因792-811位碱基之间构建的嵌合鞭毛基因片段。将fliCB fliCT片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliCB、pRE112-fliCT,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,筛选获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNcfliCB、EcNcfliCT。两株重组菌株生长、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验与EcNc无显著差异;在半固体平板上,EcNcfliCB无运动性,而EcNcfliCT具有运动性。将EcNc、EcNc fliCB、EcNcfliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和肠道,检测小鼠体内产生抗B、T细胞表位的特异性抗体IgA、IgG,结果表明,免疫重组菌株EcNc fliCB能够刺激机体产生抗B细胞表位的IgG抗体(0.552±0.027),免疫EcNc fliCT同样能够刺激机体产生抗T细胞表位IgG抗体(0.515±0.049),空白对照组(免疫EcN)未检测出针对相应包被蛋白的IgG抗体。免疫EcNcfliCB小鼠肠道能检测出针对B细胞表位的IgA抗体(0.367±0.030),与空白对照组差异显著(0.040±0.017; p=0.040);免疫EcNc fliCT小鼠肠道能检测出针对T细胞表位的IgA抗体(0.371±0.034),与空白对照组差异显著(0.024±0.010;p=0.025)。EcNcfliCB、EcNcfliCT能诱导B、T细胞表位抗原特异的体液及黏膜免疫应答。
  上述试验结果证明EcNc鞭毛蛋白不同高变区能携带一定大小的外源抗原并较好展呈于菌体表面,为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定了基础。
[专利] 发明专利 CN201410045786.9
扬州大学 2014-04-23
摘要:本发明涉及一种使用自杀性载体去除大肠杆菌Nissle菌内隐秘质粒的方法,该方法是将自杀性载体与待去除的隐秘质粒构建成重组自杀质粒,所述自杀性载体具有抗性筛选标记和自杀载体特性;用构建的重组自杀质粒转化大肠杆菌Nissle,通过抗性筛选得到仅携带重组自杀质粒的大肠杆菌Nissle;再利用自杀性载体的自杀特性筛选出丢失重组自杀质粒的大肠杆菌Nissle,从而获得去除了隐秘质粒的大肠杆菌Nissle。本发明不存在常规使用的化学、物理方法对宿主菌造成的不良影响。本方法不会对宿主菌的基因组造成影响,亦不会影响宿主菌已知的生物学特性。
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