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摘要:目的:筛选对拟穴青蟹过敏原原肌球蛋白(tropomyosin,TM)抗原表位具有特异性结合能力的适配体小肽,并鉴定适配体小肽对TM的免疫结合活性的抑制作用.方法:采用ExPASy peptide cutter软件预测TM分子中胰蛋白酶酶切位点,结合TM线性表位设计反义小肽,经AutoDock 4.0软件模拟分子对接,筛选得到适配体小肽.采用抑制性ELISA的方法,检测筛选的适配体小肽对TM与特异性IgG抗体结合活性的抑制作用.结果:TM氨基酸序列中有25个胰蛋白酶酶切位点,设计TM的31条反义小肽,利用分子对接筛选得到12个适配体小肽.抑制性ELISA结果显示,12条适配体小肽均能明显抑制TM与IgG抗体的特异性结合,其中适配体小肽5抑制能力最强,其抑制率为36.2%.结论:通过分子对接筛选得到能明显抑制TM免疫结合活性的适配体小肽,为降低TM致敏性的研究提供理论参考....
[专利] 发明专利 CN201910818141.7
集美大学 2020-01-14
摘要:本发明提供了一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用,该致敏蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。根据本发明的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因,其克隆入原核表达载体,构建重组表达质粒,再转入宿主菌并诱导表达,可获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP,利用该重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP与贝类过敏患者血清进行IgE结合能力的测定,可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供参考依据,使得针对SCP的过敏性疾病的防控和治疗及时准确。
[专利] 发明专利 CN201910816345.7
集美大学 2019-12-31
摘要:本发明提供了一种拟穴青蟹致敏蛋白的编码基因及其应用,该致敏蛋白的编码基因由SEQ ID NO:1的核苷酸序列构成。本发明还公开了含有该基因的表达载体、重组菌株;制备该致敏蛋白的方法以及该致敏蛋白的应用。根据本发明的拟穴青蟹致敏蛋白的编码基因,其克隆入原核表达载体,构建重组表达质粒,再转入宿主菌并诱导表达,可获得拟穴青蟹致敏蛋白rScy p 9,利用该拟穴青蟹致敏蛋白rScy p 9与甲壳类过敏患者血清进行IgE结合能力的测定,可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供参考依据,使得针对Scy p 9的过敏性疾病的防控和治疗及时准确。
[专利] 发明专利 CN201910718860.1
集美大学 2019-11-01
摘要:本发明涉及涂料技术领域,特别涉及一种双亲氟硅氧烷及其制备方法和应用,其中,双亲氟硅氧烷的制备方法包括以下步骤:将端氢氟硅烷加入到反应釜中,通入氮气并搅拌,加热至60℃~100℃;加入催化剂A以及VTEOS进行反应;加入催化剂B,加热至50℃~100℃,通入氮气,并加入甲基聚乙二醇乙烯基醚反应,得到双亲氟硅氧烷。反应过程简单,可合成规整的分子结构,且具有优异的双亲性能,将该分子应用到污损脱附型防污涂料(FRC)中能有效提高防污涂层对海生物的抵御性,同时该分子应用的污损脱附型涂料不含有毒防污剂,比其他类型防污涂料更具环保性;此外,该双亲氟硅烷还可应用于医学、工业、海洋等领域具有防污、防粘附、防海生物等作用的领域。
[专利] 发明专利 CN201910696578.8
集美大学 2019-10-01
摘要:本发明提供一种可复涂低黏度高膜厚乙烯基酯涂料及其制备方法,其中,该可复涂低黏度高膜厚乙烯基酯涂料,包括乙烯基酯树脂、片状填料、含硫改性化合物、磷酸盐、复合功能流变剂和其它助剂。该可复涂低黏度高膜厚乙烯基酯涂料通过片状填料、磷酸盐和含硫改性化合物的相互搭配,增强漆膜与基材的附着力,有效的增加漆膜的防腐性能;其次,组分还包括复合功能流变剂,复合功能流变剂组分包含气相二氧化硅、改性羧酸酰胺溶液、改性脲溶液和偶联剂,可有效提高涂料的触变性能,而且对涂料的黏度升高影响较小,能够进行喷涂施工作业,同时延长漆膜的服役寿命,使涂料达到低黏度、可喷涂、高膜厚的要求,单道干膜厚度达1000~1500μm,省时省工,节能节资。
摘要:目的:本研究对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)主要过敏原精氨酸激酶(arginine kinase,AK)271位的半胱氨酸进行突变,破坏分子内二硫键以期改变其致敏性。
[博士论文] 杨阳
水产 集美大学 2018(学位年度)
摘要:食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注,甲壳类水产品是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国重要的水产资源,但其产量和消费量的增加,也伴随着越来越多的食物过敏问题。对拟穴青蟹引起的食物过敏反应流行病学调查和拟穴青蟹过敏原结构、表位及其致敏性的系统分析是开发低致敏食品和甲壳类水产食物过敏性疾病控制的基础。
  本研究于2010年至2017年对大学在校生发放食物过敏流行病学调查问卷共17324份,对收回的13361份有效问卷统计结果显示,蟹类是该群体中主要的过敏食物,进一步对调查对象中14164名学生的血清学分析表明蟹类过敏比例为4.31%,而拟穴青蟹的肌浆蛋白能够被65.14%的蟹类过敏患者血清中的特异性免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E识别。精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是拟穴青蟹肌浆蛋白中的主要过敏原,本文首先通过X射线衍射获得了分辨率为3.0(A)的AK晶体结构,基于蛋白质结构的对比分析结果表明,节肢动物中的AK具有保守的一级结构、二级结构和高级结构。基于抗原表位的对比分析结果表明,不同物种中AK线性表位区域呈现高度的一致性,主要分布于氨基酸序列(amino acid,AA)25-44、AA130-155和AA308-321;而构象表位则主要分布于AK高级结构保守区。此外,本研究完成了对拟穴青蟹肌浆蛋白中新型过敏原磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM)和肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)的分离纯化,并首次发现细丝蛋白C(filamin C,FLN c)是存在于拟穴青蟹肌浆中的新型过敏原。对拟穴青蟹肌浆中四种过敏原的血清学分析结果表明,AK和FLNc能被较多的蟹类过敏患者血清识别,而识别TIM和SCP的患者血清数量较少。目前这四种过敏原已被世界卫生组织/国际免疫学会联盟(world health organization/international union of immunological societies,WHO/IUIS)的过敏原命名系统收录,AK、SCP、TIM和FLN c分别被命名为Scyp2、Scyp4、Scyp8、和Scyp9。
  采用蟹类过敏患者特异性识别的过敏原对过敏患者进行嗜碱性粒细胞激活试验(basophil activation test,BAT),以进一步确定患者的过敏反应,结果发现嗜碱性粒细胞表面抗原CD63和CD203c的表达上调与患者自诉的过敏症状严重程度呈现正相关。以经过BAT验证的过敏患者血清IgE为靶蛋白,对噬菌体展示肽库进行亲和淘选,结合生物信息学分析鉴定了AK的5个线性表位区域和8个构象表位区域、TIM的4个线性表位区域和2个构象表位区域、FLN c的6个线性表位区域和6个构象表位区域、SCP的6个构象表位区域。利用Balb/c小鼠建立的四种肌浆蛋白过敏原的动物模型表明,AK在机体内的致敏性最强,能够引起B淋巴细胞的增殖,同时产生高水平的抗原特异性IgE;TIM也能够使B淋巴细胞增殖并产生较高水平的特异性抗体,但其致敏性较AK弱;SCP虽然具有较强的免疫原性,但其免疫反应性较弱;相反FLN c虽然在体内的免疫原性较弱,但其具有较强的免疫反应性,从而能够引起效应细胞较强的激活。
  综上,本研究确定了蟹类是常见的过敏食物,而肌浆蛋白是引起蟹类过敏的重要组分;完成了拟穴青蟹主要过敏原AK的结构解析、肌浆蛋白中新型过敏原的纯化并获得了WHO/IUIS审批的系统命名;对肌浆蛋白中的四种过敏原进行了血清学分析和抗原表位定位分析,并结合动物模型比较分析了四种过敏原在机体内的作用方式和致敏性,这些结果为开发低过敏食物、甲壳类水产品过敏性疾病控制提供了理论基础。
摘要:利用硫酸铵盐析和柱层析对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)进行处理,纯化得到28 ku的新型过敏原蛋白,经质谱鉴定为磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM),与中华绒螯(Eriocheir sinensis TIM序列相似度达到93%.该过敏原蛋白能够与甲壳类过敏患者血清和兔抗克氏原螯虾多克隆抗体发生特异性反应,等电点为5.8.对热处理稳定,加热温度高于50℃时发生聚合,且多聚体仍具有免疫结合活性,pH>9.0时,对TIM免疫结合活性略有影响.在模拟胃肠液消化过程中,TIM耐受胰蛋白酶消化但不耐受胃蛋白酶消化,模拟胃液消化后的小分子片段仍保留有IgG结合活性.综合血清学及性质分析,该磷酸丙糖异构酶是拟穴青蟹的一种新型过敏原....
摘要:克氏原螯虾是重要的过敏食物之一,存在于克氏原螯虾(Procambarus clarKii)中的具有共同表位的两个新型过敏原磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM)与细丝蛋白C(filamin C,FLN c)在体内的致敏性有待进一步探究.方法:以克氏原螯虾为试验对象,通过硫酸铵盐析和柱层析的方法,从肌浆中提取纯化目的过敏原蛋白FLNc,并通过克隆表达得到重组过敏原TIM(recombinant TIM,rTIM).以FLN c和rTIM作为抗原,采用腹腔注射方式建立BALB/c小鼠过敏模型,并用流式细胞术检测过敏小鼠脾脏淋巴刺激培养后的细胞增殖情况,分析克氏原螯虾两种新型过敏原在体内的致敏性及作用机制.结果:兔抗克氏原螯虾TIM多克隆抗体的western blot分析结果显示,rTIM具有较高的IgG结合活性.BALB/c小鼠过敏模型分析结果显示,FLNc和rTIM均能够引起小鼠血清中特异性IgE、IgG1及肥大细胞蛋白酶(MMCP-1)水平的显著升高,同时能够促进Th2型细胞因子IL-4和IL-13的显著升高.但流式细胞术对淋巴细胞增殖情况的检测结果表明,TIM组小鼠T细胞增殖达4.98%,而B细胞无明显增殖;而在FLN c组小鼠的淋巴细胞检测中,B淋巴细胞增殖达9.45%,而T细胞无明显变化.结论:TIM和FLNc是克氏原螯虾中两个具有交叉反应的新型过敏原,二者都能够引起机体的过敏反应,但作用途径有所不同.
摘要:原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)是甲壳类水产动物主要过敏原之一,其抗原表位与致敏作用密切相关,根据本课题组已淘选得到TM 101-111抗原表位中的关键氨基酸,采用基因定点突变技术,用丙氨酸(Ala)替代107位关键氨基酸苏氨酸(Thr),并表达该突变体蛋白,为后续研究单个关键氨基酸的改变对其致敏性的影响奠定基础。本试验首先采用点突变技术扩增拟穴青蟹TM突变基因,构建突变体pET28a-TMT107A,将突变体转入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,获得突变体重组表达菌株,利用IPTG对其进行诱导表达,采用SDS-PACE和Western blot对重组蛋白进行鉴定。结果成功得到基因全长为855 bp的rTM-T107A突变体,分子量大小约为38 ku的重组蛋白,经鉴定该重组蛋白确实是TM突变体蛋白。本试验构建了rTMT107A突变体,利用大肠杆菌表达系统成功的表达了该突变体蛋白,后续试验可以通过抑制性Elisa等方法检测其IgE结合活性,探究其致敏性的变化。
摘要:近年来食物引起的过敏性疾病发病率持续增高,严重影响了人们的生活质量.水产品是中国主要的致敏性食物,且东部沿海地区过敏发病率较高.已发现的水产食物过敏原有小清蛋白(parvalbumin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、精氨酸激酶(arginine kinase)、肌钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein)、肌球蛋白轻链(myosin light chain)、肌钙蛋白C(troponin C)和磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase)等.水产食物过敏反应存在免疫交叉性,过敏原的抗原表位是引发过敏反应的基础,表位组成和空间构型等特征决定了抗原的特异性.本文着重对国内外水产食物过敏原及其抗原表位的研究现状进行了概述,以期为水产食物过敏疾病诊断治疗和低致敏性食品开发提供指导....
摘要:目的:本研究以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为原料,探究酪氨酸酶处理拟穴青蟹原肌球蛋白对小鼠口服耐受的影响.方法:以纯化的原肌球蛋白(TM)为研究对象,采用酪氨酸酶(tyrosinase)对TM进行交联反应处理,并分析交联产物的交联程度、免疫结合活性,建立BALB/c小鼠模型检测交联产物对小鼠口服耐受的影响.结果:从SDS-PAGE结果和扫描电镜结果分析发现,酪氨酸酶可以催化TM发生交联(交联产物命名为CTC),产生大分子物质,其交联产物的结构更加紧密;用ELISA检测发现CTC的IgE结合活性降低34.5%;经小鼠口服耐受实验,发现交联组小鼠血清IgE和IgG1的水平明显下降,脾脏中Th2型细胞因子IL-4、IL-13的水平明显降低,使小鼠在一定程度上出现了口服耐受性.结论:TM作为拟穴青蟹的主要过敏原,采用酶法交联反应处理降低其免疫原性,可使小鼠产生口服耐受.今后将继续探索其口服耐受的免疫分子机制,为以后的临床治疗提供技术依据.
[专利] 发明专利 CN201610455642.X
集美大学 2016-10-26
摘要:一种竹筒海鲜蒸饭的加工方法,涉及海鲜食品的加工方法。包括以下步骤:1)取稻米和红枣浸泡;2)将虾仁、干贝、蟹肉置于酶液中浸泡后,进行酶法交联恒温反应;3)将步骤1)和2)中所得物料混匀,装入竹筒并添加辅料,上锅蒸制后密封,冷却,即得竹筒海鲜蒸饭,速冻后保存。通过酶法交联结合热处理,可显著降低甚至消减虾、蟹、贝等甲壳类水产品的致敏性,结合调配添加多种谷类,并添加具有抗过敏作用的紫菜等辅料,于新鲜竹筒中蒸制获得低致敏性的竹筒海鲜蒸饭。具有工艺简单、操作方便等特点,所得产品味道鲜。通过特异性IgG免疫印迹分析,证明所用虾、蟹、贝的致敏性被显著降低。
摘要:目的 获取与CC趋化因子受体9(CCR9)具有亲和力的特定短肽.方法 以CCR9的第2个胞外环为靶蛋白,反复筛选Ph.D.-12噬菌体展示肽库获得阳性克隆,通过ELISA测定噬菌体阳性克隆短肽与CCR9的亲和力,共聚焦显微镜检测短肽与CCR9高表达细胞MOLT4结合能力.结果 经过3轮淘选、富,确定了8个噬菌体克隆有插入序列,其中克隆C-4与靶蛋白具有较高亲和力,表达的短肽P1 (VHWDFRQWWQPS)可抑制相应C-4克隆与靶蛋白的结合,并可与CCR9高表达的MOLT4细胞结合.结论 通过噬菌体肽库筛选出了能与细胞表面分子CCR9结合的短肽序列VHWDFRQWWQPS....
摘要:目的:本研究以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为原料,探究酶法交联对其原肌球蛋白(tropomyosin,TM)变应原性和致敏性的影响。方法:以纯化的TM为研究对象,采用酪氨酸酶(tyrosinase)对TM进行酶法交联,并采用聚丙烯酰胺凝肢电泳(SDS-PAGE)分析交联程度;模拟胃肠液消化分析交联产物消化稳定性;用免疫印迹(Western blot)和点杂交(Dot blot)分析交联产物致敏性,进一步利用小鼠食物过敏模型评价交联产物致敏性。结果:SDS-PAGE显示,酪氨酸酶可使TM产生高分子交联聚合物;TM在模拟胃液消化15 min主条带部分降解而交联产物消化60min后高分子奈带仍存在;采用过敏患者血清对交联产物进行Western blot和Dot blot分析,结果表明交联产物的lgE结合活性降低;动物实验结果显示,TM交联产物组比TM组小鼠血清IgE/IgG1含量降低3-8倍。结论:本实验建立了TM与酪氨酸酶的交联方法,发现交联产物消化稳定性升高,致敏性降低,为低致敏性水产品的开发研制提供了理论依据。
[专利] 发明专利 CN201510371519.5
集美大学 2015-09-30
摘要:一种低致敏性熟制章鱼的加工方法,涉及食品加工。将章鱼原料预处理后,在目与目之间切口至牙的位置,放入滚筒内,再加入冰盐水,滚揉后放掉冰盐水;在滚筒内加入冰明矾水,继续滚揉,取出章鱼,清洗;将清洗后的章鱼放入盐糖水中腌制;将锅中的水加热,再放入盐和还原糖,然后放入腌制后的章鱼,漂烫;将漂烫后的章鱼冷却,再放入含醋酸的冰水中冷却,取出后沥干,真空包装,杀菌后冷却。解决了传统章鱼加工过程中难以降低章鱼致敏性的难题。采用盐糖水对章鱼进行短时的腌制处理,利用还原糖与过敏原蛋白质在漂烫及高温高压杀菌过程中发生的拉德反应来降低章鱼的致敏性,同时保持章鱼原有的口感和风味。操作简便、成本低、易实现规模化生产。
[硕士论文] 杨阳
生物学 集美大学 2015(学位年度)
摘要:食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注,甲壳类动物是联合国粮农组织(FAO)公布的八大类过敏食物之一。蟹类等甲壳类水产品味道鲜、营养丰富,是重要的水产资源;但随着蟹类消费量的增加,因食用蟹类而导致过敏的报道也随之增多。精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是存在于甲壳类和软体类动物的泛过敏原,对其抗原表位的全面了解能够为开发低致敏食品和甲壳类过敏疾病的诊断治疗提供依据。
  本文首先从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)肌肉中纯化得到AK,通过体外模拟胃液降解AK,降解产物的免疫活性检测结果表明其降解产物仍具有较强的免疫原性;通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)对AK的胃液消化产物进行分离纯化,得到具有IgG/IgE结合活性的5个肽段。分别采用天然AK和分段表达产物rAK1(AA:87-186)、rAK2(AA:172-265)作为抗原建立小鼠过敏模型,以确定AK抗原表位的优势区域,结果显示天然AK组和rAK1组的小鼠血清特异性IgE、Th2型细胞因子IL-4和IL-13均显著升高,表明天然AK和rAK1能够诱导小鼠过敏反应,提示rAK1为AK的抗原表位优势区。
  采用纯化AK免疫新西兰大白兔获得兔抗拟穴青蟹AK特异性抗血清,通过ProteinA柱层析得到纯化的兔抗拟穴青蟹AK IgG,以纯化的IgG为靶蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘选,获得与抗原特异性结合的5个肽段。利用LocaPep软件分析淘选出的肽段,模拟得到4个构象表位C-AK-1(D3A4K43M1A5T49T44I7)、 C-AK-2(L31K33V35T32E11E18F14S34D37)、C-AK-3(V177G172M173D176Q178T174L181K175L187)和C-AK-4(R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145),以及关键氨基酸依次为D3,K33,T174和W204。
  根据噬菌体展示淘选结果设计合成了19个重叠肽段,利用甲壳类过敏患者血清检测发现与血清IgG特异识别结合的7个肽段(AA:113-127,127-141,134-148,141-155,204-218,211-225和316-330)和与血清IgE特异识别结合的6个肽段(AA:113-127,127-141,141-155,204-218,211-225和316-330)。进一步通过肥大细胞(RBL-2H3)脱颗粒实验确定AK的4个线性表位:L-AK-1(AA:113-127),L-AK-2(AA:127-141),L-AK-3(AA:141-155)和L-AK-1(AA:204-218)。
  利用十二烷基磺酸钠(SDS)、β-巯基乙醇(β-Me)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素和盐酸胍等变性剂处理天然AK,通过免疫印迹检测变性处理后AK的IgE结合活性变化,结果表明AK的致敏性依赖于其空间构象的完整性,存在于分子内部的二硫键Cys201-Cys271对于维持AK的空间构象具有关键作用,是影响AK致敏性的关键位点。
  综上,本研究对拟穴青蟹AK的抗原表位进行了定位分析,确定了AK致敏性的关键位点及其构效关系,这些结果为开发低致敏食品和预防治疗过敏性疾病提供理论指导。
  
摘要:随着蟹类养殖量和捕捞量的逐年增加,食用人数渐渐增多,引发的过敏性疾病也呈上升趋势,引起的相关食品安全问题日渐增多,受到社会各界的广泛关注.原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)和精氯酸激酶(Arginine kinase,AK)是蟹类重要过敏原,也是造成蟹类过敏症状的主要原因.本研究以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为实验材料,设计蟹肉粗蛋白的正交试验,研究不同条件的拉德反应对蟹肉粗蛋白的影响.结果显示,在100℃加热60 min及pH 8.5的条件下,蟹内粗蛋白与阿拉伯糖、半乳糖(质量比1∶1.5∶1.5)发生拉德反应可以有效降低蟹肉致敏性,其中TM组大鼠嗜碱性粒细胞的β-已糖胺酶释放率从51.12%下降到19.82%,AK组大鼠嗜碱性1h粒细胞的β-己糖胺酶释放率从36.63%下降到21.74%.
摘要:目的:本文以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为研究对象,对其肌肉过敏原-肌质钙结合蛋白(Sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)进行重组表达,探究重组SCP的免疫结合活性.方法:参考NCBI数据库中SCP相关序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因,将目的基因与表达栽体pET-22b连接后转化至大肠杆菌中进行表达,重组蛋白经Sephacryls-200凝胶过滤柱层析纯化,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和免疫印速(Western blot)分析重组SCP的免疫结合活性.结果:对拟穴青蟹的肌肉组织RNA进行反转录,通过PCR扩增出579bp目的基因产物;将该基因与表达栽体连接后转化至大肠杆菌中,在30℃条件下经0.5mmol/L IPTG诱导8h,重组蛋白经柱层析纯化后的SDS-PAGE显示其分子量约为21 kDa;通过与兔抗青蟹SCP多克隆抗体、蟹类过敏患者血清的免疫印迹反应分析,证实重组表达SCP具有IG/IgE免疫结合活性.结论:本研究成功表达了拟穴青蟹SCP,重组SCP具有良好的IgG/IgE结合活性,可望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发.
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