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摘要:目的 探讨Rho相关卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)及其相关信号分子在感受张应变机械刺激、调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖功能中的作用.方法 应用张应变加载系统对体外培养VSMCs施加牵张幅度10%、频率1.25 Hz生理性周向张应变;Brdu检测VSMCs增殖水平;Western blotting检测力学加载后VSMCs的ROCK1表达水平以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC) α/β Ⅱ、蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)、胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化水平;采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)检测ROCK1对VSMC增殖和PKCα/βⅡ、PKD、ERK磷酸化的调控作用.结果 10%生理性张应变加载12、24 h显著抑制VSMCs的ROCK1表达,并显著抑制PKD和ERK的磷酸化;10%生理性张应变加载12h显著抑制PKCα/βⅡ的磷酸化,但加载24 h PKCα/βⅡ的磷酸化与静止对照组相比无显著差异.RNAi抑制VSMCs的ROCK1表达后,VSMCs增殖水平显著降低,同时PKCα/βⅡ和PKD磷酸化水平显著降低,但ERK磷酸化无明显变化.结论 10%生理性张应变可能通过抑制ROCK1表达调控PKC∥BⅡ和PKD的磷酸化水平,从而影响VSMCs增殖,维持血管稳定性.探讨张应变力学刺激调控血管细胞功能的细胞内信号转导网络,对心血管生理和疾病病理机制研究具有一定意义....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA EI
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摘要:目的 探讨活化激酶C受体1(receptor for actived C kinase 1,RACK1)在内皮细胞(endothelial cells,ECs)感受切应力刺激调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用及其机制.方法 应用平行平板流动腔系统,对联合培养的大鼠ECs和VSMCs施加1.5 Pa正常切应力(normal shear stress,NSS)和0.5Pa低切应力(low shear stress,LowSS),应用BrdU ELISA方法检测VSMCs增殖水平,对蛋白质组学研究发现的力学响应分子RACK1表达以及Akt磷酸化,应用Western blot技术进行检测.静态条件下,应用RNA干扰技术特异性抑制VSMCs的RACK1表达,检测其对细胞增殖和Akt磷酸化的作用.应用ECs与VSMCs隔开培养和联合培养模型,检测ECs对VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化水平的影响.结果 血管差异蛋白质组学的结果发现,与NSS组相比,RACK1在LowSS组血管组织的表达水平明显升高.细胞实验结果显示,LowSS诱导了与ECs联合培养的VSMCs增殖,上调VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化.静态条件下,特异性抑制VSMCs的RACK1表达后,VSMCs的增殖水平和Akt磷酸化水平均显著下降.与ECs联合培养VSMCs,其RACK1表达和Akt磷酸化水平较隔开培养组均上调.结论 VSMCs的RACK1表达受细胞接触与切应力的影响,并可能通过PI3 K/Akt信号通路参与LowSS诱导的VSMCs增殖的调控.探讨VSMCs增殖功能变化及其力学生物学机制对于认识动脉粥样硬化等疾病发病机理和疾病防治有重要意义....
摘要:目的 探讨高血压条件下异常升高的周期性张应变刺激对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响,以及Forkhead转录因子1(FOXO1)在其中可能的作用.方法 构建腹主动脉缩窄高血压大鼠模型,并以假手术组为对照,应用FX-4000T体外周期性张应变加载系统,分别对VSMCs施加5%的生理性张应变和15%的高血压病理性张应变.Western blot检测VSMCs的FOXO1及p-FOXO1表达水平,BrdU法检测VSMCs增殖活性.RNA干扰技术抑制VSMCs的FOXO1表达,检测FOXO1、p-FOXO1表达以及VSMCs增殖活性变化.结果 腹主动脉缩窄术后2和4周,大鼠血压较假手术大鼠明显增高.与假手术大鼠相比,高血压大鼠血管壁细胞增殖活性明显增高,同时FOXO1及p-FOXO1表达水平也显著性升高.细胞实验表明,与5%张应变组相比,15%张应变加载显著上调VSMCs的FOXO1、p-FOXO1表达水平,以及VSMCs增殖活性.静态条件下RNA干扰抑制VSMCs的FOXOI及p-FOXO1表达,VSMCs的增殖活性明显降低.结论 高血压病理条件下,异常增高的周期性张应变可能通过促进FOXO1表达和磷酸化诱导VSMCs增殖.以动物模型观察现象,在细胞分子水平探讨机制,旨在明确FOXO1在高血压血管重建中的作用及其力学生物学机制,为阐明高血压血管重建的发病机理和药物治疗靶标的研究提供新的实验依据....
[硕士论文] 杨煜晨
生物医学工程 上海交通大学 2014(学位年度)
摘要:诸多研究表明,机械应力(mechanical strain)尤其是张应变,在血管生理稳态维持和血管重建病理机制中均起到重要作用。探讨张应变力学刺激调控血管细胞功能的细胞内信号转导网络,研究其中关键蛋白的生物学效应,对心血管生理和疾病病理研究有重要意义。
  蛋白质转录后的可逆性磷酸化修饰参与了几乎所有生命活动的调节。然而,生物体内通过可逆性磷酸化修饰参与细胞内信号转导的蛋白质通常仅占细胞内蛋白质总量的不足10%,应用传统蛋白质组学技术分离鉴定差异表达的蛋白质过程中,磷酸化蛋白往往由于表达丰度低而得不到有效显示。所以,我们将稳定同位素标记活细胞培养(SILAC)、TiO2亲和层析结合质谱分析(MS)的磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)技术应用于张应变调控血管平滑肌细胞(VSMCs)的细胞内信号转导网络研究,以期从整体上观察张应变诱导的细胞中全部蛋白质磷酸化修饰的状态及其变化。
  应用SILAC技术标记体外培养大鼠VSMCs,应用FX-4000张应变加载系统施加不同时长的生理性张应变:幅度10%,频率1.25 Hz,时间分别为0,15 min,30 min,1 h及6 h。TiO2亲和层析结合质谱分析(MS)得到了时间序列的VSMCs内磷酸化蛋白质的表达谱及相应肽段的特异磷酸化位点。之后,运用DAVID数据库、IPA软件等生物信息学方法对上述磷酸化蛋白质组学数据进行功能分析、信号通路分析和模糊C均值聚类分析(FCM),得到了10%-1.25Hz周期性张应变加载条件下VSMCs内磷酸化发生显著变化的蛋白所参与的主要细胞功能及可能的张应变细胞内信号转导网络。结果提示,Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK)及蛋白激酶C(PKCs)家族可能参与了张应变调控的VSMCs功能。
  为深入探讨上述磷酸化蛋白质组学及生物信息学提示的力学响应分子ROCK、蛋白激酶家族在张应变调控VSMCs功能中的作用,我们首先应用western blotting(WB)技术检测了10%-1.25Hz生理性张应变加载不同时间(0 min,15 min,30 min,1 h,6 h,12 h和24 h)后ROCK1,蛋白激酶家族成员p-PKCθ、p-PKCα/β、p-PKCζ/λ、p-PKCδ/θ、p-PKD/PKCμSer916、p-PKD/PKCμSer744/748以及p-Akt随时间变化的磷酸化蛋白质表达情况;之后,应用RNA干扰技术探究了ROCK1在其中的调控作用。本部分结果表明:(1)生理性张应变加载24 h显著提高VSMCs活性;(2)生理性张应变显著抑制ROCK1的表达;(3)生理性张应变分别在短时相(15 min&30 min)、长时相(6 h&12 h&24 h)两次激活p-PKCθ,但是对p-PKCα/β,p-PKCζ/λ,p-PKCδ/θ无显著影响;(4)生理性张应变激活p-Akt和p-PKD/PKCμSer744/748是一个瞬时、短暂的效应(15 min&30 min),但对p-PKD/PKCμSer916位点的激活则较Ser744/748位点持续更久(持续到1 h);(5)干扰ROCK1促进PKCθ、PKD/PKCμ Ser916及PKD/PKCμ Ser744/748的磷酸化,但抑制Akt的磷酸化。
  基于上述磷酸化蛋白质组学及后续实验验证两部分的结果,我们得出结论:生理性张应变能够增强VSMCs活性,从而发挥保护功能;该功能的实现可能是通过复杂的细胞内信号转导网络实现,其中生理性张应变抑制ROCK1表达,从而调控PKCθ及Akt的磷酸化可能起到重要作用。我们的研究为探明机械应力诱导之血管重建的分子学机制提供了新思路,为心血管疾病的研究提供了一定的实验依据和理论基础。
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