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摘要:为研究阿司匹林对人慢性粒细胞白血病细胞株K562生长的影响,采用光学显微镜和Hoechst 33258 染色观察阿司匹林处理后细胞的形态和数目变化,显示阿司匹林促进K562细胞的凋亡.MTT法、细胞计数、软琼脂克隆形成实验、FACS和裸鼠成瘤实验在体外和体内检测阿司匹林对K562细胞增殖和存活的影响,发现阿司匹林明显抑制K562细胞的体外增殖和裸鼠体内成瘤能力.Western blot实验分析细胞信号通道下游基因的表达影响,显示β-catenin、STAT5A、PARP和NF-κB p65蛋白的表达量下调,而细胞周期抑制因子p21表达上调.这些结果提示阿司匹林从体外和体内抑制K562细胞的生长,其作用的机制复杂,可能影响β-catenin信号通道、JAK蛋白酪氨酸激酶/STAT5A信号通道、NF-κB信号传导通道和细胞周期的进程.
摘要:为了深入研究GAS41在胚胎发育中的作用机理,应用生物信息学软件分析了斑马鱼GAS41基因的序列特征;采用RT-PCR、整体原位杂交和整体免疫组织化学方法检测其在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱.结果显示斑马鱼GAS41蛋白与人类、小鼠、大鼠同源蛋白都有91.2%的同源性,具有高度的保守性.RT-PCR结果表明GAS41在检测的成体组织中均有表达,表达丰度相当.而GAS41在胚胎受精后一直持续表达,其中受精4h后表达量升高.整体原位杂交和免疫化学结果显示GAS41特异性表达于胚胎头部,尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显.这些都提示GAS41是一个高度保守基因,在斑马鱼中枢神经系统发育过程中可能起重要作用,同时也为GAS41在胚胎发育调控中的作用机制提供实验基础.
摘要:应用亚克隆方法构建pEGFP-C3/Eps8真核表达载体,经测序鉴定后,用脂质体进行胶质瘤U251细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达pEGFP-C3/Eps8和pEGFP-C3的细胞系,最后通过Western blot和荧光定位证明Eps8在U251细胞中过量表达.本实验成功建立了稳定转染Eps8的U251细胞系,为进一步研究Eps8基因在胶质瘤中的功能奠定了良好的实验基础.
[硕士论文] 杨子剑
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2012(学位年度)
摘要:人Eps8(Epidermalgrowthfactorreceptorpathwaysubstrate8)蛋白是一类重要的信号分子。最初被鉴定为表皮生长因子受体EGFR的重要激酶活性底物之一,后来发现Eps8也是受体酪氨酸激酶的活性底物。人的Eps8基因定位于第12条染色体上,编码的蛋白有两个亚型:P97(97KD)和P68(68KD)。研究表明,Eps8可以调节表皮生长因子EGF依赖的小G蛋白Rac的活性进而调控细胞骨架肌动蛋白的构建和重排。Eps8还能调节Rab5的活性,参与受体介导的细胞内吞作用并影响Ras和Rac之间的信号转导。此外Eps8还参与多种肿瘤细胞的增殖和侵袭,增强促有丝分裂信号的释放从而导致肿瘤细胞的恶变。
   本文中我们用酵母双杂交的方法,以Eps8作为诱饵蛋白对人脑cDNA文库进行筛选,鉴定出了一个新的与Eps8相互作用的蛋白-ITSN2。我们克隆并表达了ITSN2基因,免疫共沉淀实验的结果证实了Eps8和ITSN2蛋白在体内能够结合。同时发现无论是内源的还是外源的Eps8和ITSN2蛋白都在细胞质中有明显的共定位。GSTpull-down实验证实了Eps8和ITSN2在体外能够相互作用。此外,我们对Eps8蛋白和酵母双杂交筛选出的ITSN2片段进行了分段表达,进一步证实了Eps8和ITSN2蛋白的相互作用区域,即Eps8的260-306位氨基酸区域和ITSN2的CC结构域。这些结果清楚地表明Eps8和ITSN2蛋白在体外和体外都能相互作用。
   本文还初步研究了Eps8和ITSN2蛋白相互作用的生理功能。蛋白质的降解实验和免疫荧光实验表明过表达ITSN2诱导Eps8蛋白质的降解。Eps8蛋白质的降解通过加入溶酶体抑制剂氯化铵后能够得到显著缓解,说明ITSN2可能通过溶酶体途径促进Eps8蛋白的降解。这些结果表明ITSN2能与Eps8相互作用并促进其降解。
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