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[期刊论文] 杜文 王谦 王佳堃 刘建新
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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:木聚糖酶在天然材料中基因表达水平低、活性差、生产成本高,严重限制了它的推广应用.宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在开发微生物酶资源上具有强劲的优势.体外定向进化技术模拟达尔文的自然进化论,利用基因的突变和重组,从体外改造酶基因,产生基因多样性,并结合定向的筛选最终获得预期性状的进化酶.宏基因组技术与体外定向进化技术结合必将加速木聚糖酶的开发和产业化应用,推动半纤维类生物能源的利用.为此,本文就木聚糖酶基因的来源、宏基因组学在木聚糖酶基因开发中的应用、体外定向进化进行了系统的综述....
[期刊论文] 杜文 张霄宇 葛冰
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CSTPCD 北大核心
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摘要:锑是一个可长距离输送的全球性有毒元素,但锑在河口不同环境要素中的迁移、转化以及其地球化学行为特征最近才引起国际社会的关注.为了揭示锑元素在长江口及其邻近海域的富集程度、物质来源及其潜在生态环境影响,本次研究以长江口及邻近海域29.5°~32.5°N,121°~ 124.5°E区域内表层沉积物样品为研究对象,基于沉积物全样Al、Ca、Si、Ni等主量元素,以及Cd、Cr、Cu、Pb、Sb、Sr、Zn等微量元素的含量检测分析,并采用地积累指数和潜在生态风险指数展开了锑元素在研究海域表层沉积物中累积程度和潜在生态风险.研究结果表明研究区内表层沉积物中的锑含量范围为0.44~4.41 μg/g,平均值为1.15 μg/g;已达到了偏中度污染水平,并且具有着较高的潜在生态风险,尤其是在长江入海口南支与杭州湾内锑元素具有很高的潜在生态风险.通过主成分分析方法认为锑元素的主要物质来源为长江径流输入以及人为活动输入....
摘要:长江口已成为世界低氧海域的一个代表性区域.近年来长江口低氧区的分布范围不断扩大,强度不断加剧.对该低氧区的表现特征、形成机制、生物地球化学过程以及生态环境影响做系统的分析和综述,并结合世界多处典型低氧区开展对比分析,认为长江口低氧区域在地理学、海洋学上均不同于波罗的海、黑海以及东京湾等区域的低氧区,是全球低氧生态学研究的一个新的案例.该区域的深入研究将有望丰富海洋生态学研究范畴.通过综合地球化学、生态学、物理海洋学等多学科方法和技术手段,发展低氧生态学,为研究海洋低氧现象的形成机制和生态效应,以及开展防治提供方法和理论支持....
[硕士论文] 杜文
海洋地质 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:本次研究基于长江口及其邻近海域(29.5°N~32°N,120°E~127.5°E)表层沉积物中主量、微量以及稀土元素含量数据,全面系统地分析沉积物中不同微量元素的分布特征,探讨了表层沉积物中微量元素的物质来源,以及影响其分布特征的主要控制因素,并对研究区域不同微量元素的污染程度和潜在生态风险开展了评价,研究取得以下结论:
  研究区表层沉积物中各微量元素的分布规律显著,主要可以分为4种分布形式:双核型、单核型、渐变型、多核型。第一种分布形式为双核型,包括大部分微量元素与稀土元素,元素含量的分布趋势表现为随着离岸距离的增加,在长江口南支、杭州湾口、以及长江口门外出现高值区,随后急剧降低,同时,在研究区域的东北部泥质区出现另一高值区,其含量略低于河口附近的高值区,形成双核分布。在双核高值型中又可以分为以下2类:第Ⅰ类:元素含量分布的双核构造受水动力条件的影响,具有近岸高值大于离岸高值的特点,且在等值线图中在都有东南向的舌状递减过程;第Ⅱ类:元素含量分布图表现为东北部的离岸高值略高于近岸高值,可能指示着元素之间地球化学行为的差异以及沉积环境的不同;第二种分布形式为单核型,在河口近岸分布趋势一般较高,随着离岸距离的增加含量逐渐降少;第三种分布形式为渐变型,在递增的过程中等值线由舌状逐渐转变为条状;第四种分布形式为多核型,元素含量分布趋势为在长江口南支和杭州湾均表现为低值区,但是在长江口北侧有一明显的高值区分布,同时在研究区域的中部、以及东北区有两个高值区分布,从西向东,呈现出复杂的高-低-高-低-高交错的分布特征。
  进一步对研究区微量元素开展聚类分析,结果表明表层沉积物中的微量元素的种类可以分为3种:第一种是亲粘土性元素,分布特征上表现为双核型和单核型;第二种是重矿物元素,分布特征上对应于双核型中第Ⅱ类型和多核型;第三种是海洋自生性元素,分布特征上表现为渐变型。对微量元素进行主成分分析和各种相关性分析表明,影响微量元素含量分布的主控因素为粒度控制因素、氧化还原环境因素、元素物质来源因素以及海源生物来源因素。
  为了得到研究区内微量元素的环境污染评价,采用地积累指数法结果表明,研究区内Er、Sb、Tm和Tl元素都受到中度污染,而在Z10、Z16、Z18、Z19、Z20和Z22这6个站位中,绝大部分元素的地积累值都大于0,评价为轻度污染,这些站位主要位于长江口南支入海口和杭州湾以及杭州湾口附近,表明该区域的元素累积程度偏高;利用潜在生态风险评估方法,发现在上述区域内的站位潜在生态风险值都较高,特别是在长江以南入海口Sb元素的潜在生态风险很高,值得有关部门关注。
[专利] 发明专利 CN201310463629.5
浙江大学 2014-01-22
摘要:本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法。一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶,利用基因克隆和酵母表面展示技术将一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的木聚糖酶编码基因ORF6-UN展示到酿酒酵母表面上,诱导表达后,离心回收细胞沉淀,经冷冻干燥后得到细胞干粉,该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶;木聚糖酶编码基因ORF6-UN的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶可作为饲料添加剂补充到动物日粮中,将这种瘤胃源全细胞木聚糖酶添加到动物饲粮中,不仅能增加动物的营养摄入,还能提高动物对纤维物质的利用效率。
摘要:反刍动物瘤胃中含有大量能分泌木聚糖酶的微生物,然而通过纯培养技术分离到的微生物种类极少.为了开发新型木聚糖酶基因资源,获取优良的木聚糖酶基因,本实验室构建了湖羊瘤胃微生物Fosmid文库,采用刚果红染色分析筛选具有木聚糖酶活性的阳性克隆,选取透明圈最大的克隆进行测序分析.设计引物,PCR分别扩增木聚糖酶基因全长和催化域,经HindⅢ和BamHI双酶切,与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),经1mmoL/L IPTG诱导表达后,超声波破碎菌体回收蛋白,用Ni-NTA树脂亲和层析纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析检测其分子量,采用Bradford法测定蛋白含量,以1%的木聚糖为底物,DNS还原糖法测定酶活性,计算比活力.在pH值6.0的条件下,测定酶的最适反应温度;在50℃、60℃、70℃和80℃条件下分别孵育不同时间(2min、10min、30min、60min)后测定酶的残余活性,分析酶的热稳定性.在最适温度条件下,分别测定ORF6-UN和ORF6的最适pH值;在室温(25℃)条件下,测定酶在不同pH值缓冲液中孵育2h后的残余活性,分析酶的pH值稳定性.结果显示从Fosmid文库的12 704个克隆中筛选到18个具有木聚糖酶活性的阳性克隆.序列分析结果表明,HF94含有一个编码内切木聚糖酶的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)6,编码355个氨基酸,该蛋白与产琥珀酸丝状杆菌S85产生的β-1,4-内切木聚糖酶氨基酸序列相似性为61%,由催化域(ORF6-UN)、连接肽和一个未知区域三部分构成,该催化域属于糖基水解酶家族11(GH11)(plam00457).SDS-PAGE和Western blot结果显示,ORF6和ORF6-UN蛋白的分子量分别约为43ku和34ku,与推导的蛋白分子量一致.纯化后ORF6的比活力为616.67U/mg,最适反应温度为60℃,最适pH值为5.0;纯化后ORF6-UN的比活力为1 150.00U/mg,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0.未知区域的存在降低了木聚糖酶的比活性,但是却增加了它的热稳定性和pH值稳定性.结果表明,该木聚糖酶比活力较高,优于从环境中分离得到的其他木聚糖酶,具有进一步研究和应用的潜质.
[硕士论文] 杜文
动物营养与饲料科学 浙江大学 2014(学位年度)
摘要:木聚糖酶广泛应用于食品、饲料、能源、纺织和造纸等工业中,然而,由于其在天然材料中表达水平低、活性差、热稳定性低以及生产成本高等因素,严重限制了它的推广应用。反刍动物瘤胃中含有大量能分泌木聚糖酶的微生物,然而通过纯培养技术分离得到的微生物种类极少。本实验室通过构建湖羊瘤胃微生物Fosmid文库筛选到一个酶活性较好的木聚糖酶克隆,通过测序分析,发现其含有调控碳水化合物代谢的开放阅读框(Open reading frame,ORF)6、7和30,其中ORF6编码一个与产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)S85产生的β-D-1,4-内切木聚糖酶相似度为61%的内切木聚糖酶。对ORF6所编码的蛋白质进行三级结构预测,发现其含有一个催化结构域(Catalytic domain,CD)和一个未知区域(Unkonwn domain,UN),这两个区域由一段连接肽(Linker peptide,LP)连接在一起。为了满足饲用木聚糖酶的工业生产需要、开发半纤维类生物能源,本研究采用体外定向进化技术改良该木聚糖酶的催化活性,结合酵母表面展示技术构建相应的全细胞木聚糖酶以提高木聚糖酶的热稳定性,并通过体外瘤胃发酵实验对全细胞木聚糖酶的应用性能进行评估,主要结果如下:
  1.UN的木聚糖结合能力分析本研究克隆了木聚糖酶基因orf6中编码未知区域的基因un,获得重组大肠杆菌UN。将UN与包含未知区域的木聚糖酶基因orf6及不含未知区域的木聚糖酶基因orf6-un的重组大肠杆菌HB2和HA2一起进行原核表达。亲和层析纯化后,对HA2、HB2和UN的木聚糖结合能力进行Native-PAGE分析。结果显示,HA2、HB2和UN均无木聚糖结合能力,说明UN不是木聚糖结合域。
  2.木聚糖酶基因orf6-un的体外定向进化UN不具有木聚糖结合力,且其存在会降低木聚糖酶的比活力,为此,选取不含未知区域的木聚糖酶基因orf6-un作为定向进化的基因材料。首先,利用易错PCR(error-prone PCR,EP-PCR)产生随机突变,然后采取96微孔板结合DNS法筛选木聚糖酶催化活性提高的优势突变体。第一轮EP-PCR后共筛选1450个转化子得到一个酶活性提高的克隆C12。将C12的基因作为亲本进行第二轮EP-PCR,共筛选2500个转化子得到3个酶活性提高的克隆,其中酶活性最高的克隆是E12。纯化后的野生型酶HA2、突变体酶C12和E12的比活力分别为59.02 U/mg、68.03 U/mg和120.30 U/mg。酶学特性分析发现,HA2、C12和E12的最适温度均为50℃,但是C12、E12的热稳定性低于HA2。HA2和C12的最适pH均为5.0,E12的最适pH为6.0,三者的催化活性在pH小于5.0或者大于8.0条件下显著下降。pH稳定性研究结果表明,三者在pH5.0-9.0的条件下均能保持约85%的活性。与HA2相比,C12有2处氨基酸发生突变(Q14H和K57R),这导致其Km值和kcat值分别下降78%和77%,催化效率(kcat/Km)提高1.06倍。第二轮EP-PCR后,E12在C12的基础上又多了2处氨基酸突变(V20A和M53I),这使得其催化效率(kcat/Km)进一步提高9%。三维结构分析发现,M53I替换使酶内核部分的疏水性增加,它可以避免内核与水分子的结合,增加催化活性中心与底物的结合机会,这可能是E12催化效率提高的原因。
  3.全细胞木聚糖酶的构建采用酵母表面展示技术,构建野生型全细胞木聚糖酶(Whole-cell xylanase,WCX)和突变型全细胞木聚糖酶(Whole-cell xylanase mutant,WCXm)。首先,克隆木聚糖酶基因orf6-un(亲本型)和orf6-unm(突变型),将其插入pYD1构建穿梭质粒,然后采用PEG/LiAc法转化酿酒酵母EBY100,获得重组酿酒酵母工程菌。在无氨基酵母氮源-酸水解酵素(YNB-CAA)培养基中,采用2%半乳糖诱导使木聚糖酶展示于酵母表面。利用免疫荧光检测和酶活检测确认全细胞木聚糖酶的正确表达后,通过冷冻干燥,得到粉末状的全细胞木聚糖酶。酶学性质研究发现,WCX和WCXm的最适温度均为50℃,在50℃孵育30min,能保持约80%的酶活性,在90℃孵育30 min,能保持约40%的酶活性,与原核表达的相应木聚糖酶(HA2和E12)相比,热稳定性提高,说明酵母表面展示技术有助于提高木聚糖酶的热稳定性。
  在各自的最适条件下测定全细胞木聚糖酶的酶活,经鉴定,WCX的酶活性为28 U/g(指每克细胞干重的木聚糖酶酶活为28 U),WCXm的酶活性为33U/g。
  4.全细胞木聚糖酶对体外瘤胃发酵的影响本研究以玉米秸秆为底物,采用体外瘤胃发酵技术评估全细胞木聚糖酶的应用效果。试验采用单因子试验设计,设置4个处理组,分别为空白对照组、EBY100组、WCX组和WCXm组,底物为干物质含量0.5 g的玉米秸秆,培养液为50 ml体积1∶9的瘤胃液和人工唾液,各处理按照2g/L培养液的水平添加,每个处理设置4个重复。体外试验瘤胃液取自3只安装永久性瘤胃瘘管的湖羊。培养结束后,利用DNS法分析瘤胃微生物酶活,采用绝对定量PCR技术分析瘤胃微生物主要菌群的数量变化,借助代谢组学分析技术研究瘤胃微生物代谢产物的变化,以初步探讨全细胞木聚糖酶影响瘤胃发酵的机理。
  体外瘤胃发酵结果显示:WCXm从第3h开始就显著增加了产气量(P<0.05),WCX和EBY100从第6h开始显著增加产气量(P<0.05),且二者之间差异不显著(P>0.05);全细胞木聚糖酶和EBY100的添加均显著提高了发酵液乙酸、丙酸、丁酸和总挥发酸的含量以及氨态氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)的浓度(P<0.05),其中添加WCXm的效果显著优于EBY100和WCX(P<0.05);全细胞木聚糖酶的添加显著提高了干物质降解率(Dry matterdegradation,DMD)(P<0.05),而EBY100对DMD的影响不显著(P>0.05)。以上结果表明全细胞木聚糖酶对瘤胃发酵具有促进作用,并且WCXm的效果优于WCX。
  瘤胃微生物酶活分析结果显示:与对照组相比,EBY100的添加显著增加了瘤胃微生物木聚糖酶、纤维素酶和羧甲基纤维素酶的酶活(P<0.05);全细胞木聚糖酶中只有WCXm的添加显著增加了纤维素酶酶活(P<0.05)。
  荧光定量结果显示:与对照组相比,全细胞木聚糖酶和EBY100的添加显著增加了总菌、白色瘤胃球菌的数量(P<0.05),显著减少了黄色瘤胃球菌的数量(P<0.05),对真菌的数量均没有显著影响(P>0.05);EBY100的添加显著增加了产琥珀酸丝状杆菌的数量(P<0.05),全细胞木聚糖酶对产琥珀酸丝状杆菌的数量没有显著影响(P>0.05)。
  代谢组分析结果显示:EBY100、WCXm和对照组之间的瘤胃微生物代谢有明显的差异。差异性代谢产物分布在多个代谢途径上,选取涉及碳水化合物代谢途径、能量代谢途径、脂质代谢途径的差异性代谢产物进行分析。涉及碳水化合物代谢途径的差异性代谢产物有50个,分布于13个代谢通路;涉及能量代谢途径的差异性代谢产物有26个,分布于6个代谢通路;涉及脂质代谢途径的差异性代谢产物有42个,分布于14个代谢通路。在这3个代谢途径中,EBY100的添加下调的差异性代谢产物个数多于上调,WCXm的添加上调的差异性代谢产物的个数多于下调,且多于EBY100。以三羧酸循环为中心比较WCXm与EBY100涉及碳水化合物代谢途径中的部分差异性代谢产物,发现WCXm的添加优化了碳水化合物代谢途径,进而促进了瘤胃发酵,这表明WCXm的添加对瘤胃发酵的促进作用仅部分来源于EBY100。
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