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[硕士论文] 李萌琪
植物保护 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:随着全基因组测序技术的不断发展,越来越多的昆虫物种全基因组测序工作完成。加之众多昆虫学工作者的努力,基因注释工作不断展开,大量的数据涌现在科研人员面前。如何深入研究和挖掘这些信息背后隐藏的基因功能信息成为问题的关键,解决这个问题的重要手段是靶向基因组编辑技术。CRISPR(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeat)系统是存在于细菌和古生菌中抵抗噬菌体DNA的免疫机制。在人们利用的第Ⅱ类CRISPR系统中,Cas9蛋白可以在一小段gRNA的引导下对基因组特定位点进行识别并切割,产生双链断裂,然后生物体通过不同的机制进行修复,从而实现靶向基因组编辑。本研究以模式昆虫黑腹果蝇Drosophila melanogaster(双翅目:Diptera;果蝇科:Drosophilidae)为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术,对眼色决定基因white进行靶向编辑,并利用tRNA-gRNA技术实现多位点打靶CG18208基因。
  1利用CRISPR/Cas9技术敲除果蝇white基因
  从flybase(http://flybase.org/)上下载得到果蝇white基因CDS序列,分析其内含子与外显子区域。通过flycrispr网站的Flycrispr Optimal Target Find(http://flycrispr.molbio.wisc.edu/tools)查找并选择合适的靶位点。体外转录得到Cas9 mRNA和gRNA,按照Cas9 mRNA300ng/μL、gRNA40 ng/μL的浓度注射到红眼野生型果蝇Canton-S早期胚胎生殖细胞系中。得到的G0代果蝇通过自交得到G1代,并未观察到白眼突变,分析可能是操作过程中RNA降解所致。接下来利用pDCC6质粒自带的启动子在体内同时转录得到Cas9mRNA和gRNA。将制备好的质粒以400ng/μL的浓度注射到果蝇早期胚胎中,成功在G1代观察到白眼突变表型。通过分子检测到G1代在相应的靶位点产生碱基的缺失。
  2利用tRNA-gRNA技术实现多位点打靶CG18208基因
  从flybase(http://flybase.org/)上下载得到果蝇编码章鱼胺受体的CG18208基因CDS序列,分析其含子与外显子区域。通过flycrispr网站的Flycrispr OptimalTarget Find(http://flycrispr.molbio.wisc.edu/tools),查找并选择合适的靶位点。将4个gRNA同时克隆到pCFD5质粒中得到pCFD5-OA3质粒,其中利用单一U6:3启动子启动转录得到一个长的RNA转录本,通过生物体内在的tRNA精确剪切系统,最后得到独立的4个gRNA。另外制备含有两个1kbp同源臂的OA3-donor质粒,该质粒含有GAL4和mini-white元件,预计这两个元件将定点插入到CG18208靶位点。将这两个质粒以pCFD5-OA3400 ng/μL、OA3-donor250 ng/μL的浓度注射到生殖细胞系特异表达Cas9的转基因果蝇中。得到的G0代果蝇与三号染色体TM3/TM6平衡子果蝇杂交,最终我们通过Sanger测序、TIDE分析和HRMA方法检测到靶位点突变。
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