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[期刊论文] 刘涛 王晓婕 李英俊 彭楠
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CSTPCD 北大核心
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摘要:冰岛硫化叶菌是古菌研究中常用的模式菌株,为人们研究古菌复制、细胞周期以及CRISPR-Cas系统等作出了巨大贡献.冰岛硫化叶菌遗传操作体系的建立与完善对古菌学的全面深入研究起至关重要的作用.本文介绍了冰岛硫化叶菌遗传操作体系所使用的质粒载体、筛选标记和转化方法,论述了目前广泛使用的两类冰岛硫化叶菌基因敲除体系.最后提出了现有冰岛硫化叶菌基因操作体系存在的主要问题,并对其发展方向进行了展望.
[博士论文] 李英俊
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统广泛分布于古菌和细菌中,是一种抵御病毒和质粒等外源遗传物质的获得性免疫系统。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统已被分为两大类和六个亚型,其中主要的三个亚型(Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型)得到了广泛的研究。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统目前已被广泛应用于不同的细菌和真核生物的基因组编辑;此外,Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR-Cas系统还被开发成抗菌剂来选择性消除特定的菌群。但是,迄今还没有利用Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的报道。
  本研究在冰岛硫化叶菌中开发了一种基于其内源的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法。该方法只需要构建一个新型的基因组编辑质粒(pGE),该质粒携带一个提供能靶向干涉或沉默基因的成熟CRISPR RNA的人工mini-CRISPR簇以及一个含有非靶标序列的用于同源重组的供体DNA片段。将pGE质粒转化到宿主细胞之后,细胞将会有两种命运:野生型细胞因基因组DNA被靶向降解而死亡;而那些基因组与供体DNA发生了同源重组从而携带突变基因的细胞能免于干涉而成为转化子存活下来。利用该方法,本研究实现了不同类型的基因组编辑,包括缺失、插入和定点突变。我们相信该方法可以推广到其它含有能干涉DNA的CRISPR-Cas系统的细菌和古菌。
  研究不同CRISPR-Cas系统的分子机制是应用开发的基础,且已成为当前生物学研究的热门领域之一。已有研究表明,Ⅲ型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性,其既有RNA酶活性也有RNA激活的DNA酶活性。我们的前期研究已经揭示了冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统在体内同时具有RNA干涉活性和依赖于转录的DNA干涉活性。为了更深入的解析相关机制,本研究用一个携带43nt SS1spacer(靶向lac基因上protospacer SS1)的人工mini-CRISPR质粒,从冰岛硫化叶菌中纯化出天然Cmr-α复合物,并对其进行了系统的体外研究。研究发现,Cmr-α复合物能切割与复合物中的crRNA互补配对的靶标RNA,同时该靶标RNA又能激活Cmr-α复合物的ssDNA切割活性,该活性需要靶标RNA的3'端侧翼序列与crRNA的5'端tag序列错配。此外,激活的Cmr-α复合物能够快速切割大量的ssDNA底物,这说明Cmr-α系统可以快速消灭复制中的病毒DNA。
  为了揭示Cmr2α蛋白在Cmr-α系统DNA干涉活性中的功能,本研究针对Cmr2α的HD和Palm两个结构域构建了四个突变株,分别命名为HD-M1(H14N和D15N),HD-M2(H14N, D15N,K19A和I23A), Palm-M1(G666K和D667K)和Palm-M2(662-IYlGGDDiLA-671—AAlAAAAiAS)。体内干涉质粒分析显示,其中3个多氨基酸突变株HD-M2、Palm-M1和Palm-M2都丧失了DNA干涉活性。而HD结构域的双氨基酸突变株HD-M1却只是消除了体外的DNA切割活性。这些结果表明,Cmr2α的HD和Palm两个结构域都是Cmr-α系统体内DNA干涉所必需的,而体外检测到的ssDNA切割活性可能只是HD结构域介导的。
  此外,Ⅲ型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究用携带不同长度spacer(14,20,28,40和76nt)的人工mini-CRISPR质粒分别纯化Cmr-α复合物。结果显示,无论spacer长短,Cmr-α系统都合成固定长度的crRNA(40nt和46 nt)。这说明mini-CRISPR簇下游的repeat元件可以在没有被加工情况下补充为crRNA序列。此外,一个仅含有上游repeat元件和40nt spacer的人工mini-CRISPR质粒也能合成一样固定长度的crRNA。这些结果表明,Cmr-α复合物的组装可能是从crRNA的5'端tag区域(经Cas6初加工产生)起始,而crRNA的3'端则由其它未知的RNase加工成熟,从而组装成两个固定大小的复合物。另外,对这些复合物的体外切割活性和结合靶标RNA能力的分析表明,随着复合物中crRNA的3'端区域和靶标RNA的5'端序列错配碱基数的增加,不能被复合物结合和切割的RNA底物的数量也随之增加。
  在Ⅲ-B型效应复合物的结构模型中,结合crRNA的3'端区域的是Cmr1亚基。本研究在冰岛硫化叶菌中构建了一个Cmr1α缺失突变株和两个关于Cmr1α的丙氨酸替换突变株,分别命名为△β△1α,△β1α-M1(W58A和F59A),△β1α-M2(I52A,G54A,R57A和R61A)。体内基于mini-CRISPR的报告基因法分析表明,△β1α-M1的RNA干涉活性相比野生型菌株大大降低,而△β△1α和△β1α-M2则基本丧失了RNA干涉活性。
  纯化Cmr1α三个突变株的Cmr-α复合物发现,突变株△β1α-M1 Cmr-α复合物的组分和野生型基本一样,而突变株△β1α-M2 Cmr-α复合物的组分却和△β△1α一样,都缺少Cmr1α蛋白。同时,体外RNA切割实验与体内的RNA干涉活性分析结果一致。在靶标RNA激活的DNA切割活性分析中,突变株△β△1α和△β1α-M2的复合物均基本丧失了DNA切割活性,突变株△β1α-M1的Cmr-α复合物也只检测到相比野生型复合物非常弱的DNA切割活性。此外,EMSA实验结果显示,△β△1α和△β1α-M1的Cmr-α复合物均很难与靶标RNA形成三元复合物(Cmr蛋白,crRNA和靶标RNA)。以上结果表明,Cmr1α在Cmr-α复合物与靶标RNA形成三元复合物过程中扮演关键角色。两个保守的疏水氨基酸(W58和F59)是Cmr-α复合物结合靶标RNA所必需的,另外四个氨基酸(I52,G54,R57和R61)可能主要介导Cmr1α与crRNA相互作用,从而形成完整的Cmr-α复合物。
摘要:Clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats(CRISPR)loci and(C_)RISPR(as-)sociated genes(cas)constitute bacterial and archaeal adaptive immunity system against phages and other invading genetic elements.Acquisition of de novo spacer sequènces confers CRISPR-Caswith a memory to defend against invading genetic elements.However,the mechanism of regulation of CRISPR spacer acquisition remains unknown.Here we examine the transcriptional regulation of the conserved spacer acquisition genes in Type I-A of Sulfolobus islandicus REY15A.Csa3a,a MarR-like transcription factor encoded by the gene located adjacent to csa1,cas1,cas2 and cas4 cluster,but on the reverse strand,was demonstrated to specifically bind to the csa1 and cas1 promoters with the imperfect palindromic sequence.Importantly,it was demonstrated that the transcription level of csa1,cas1,cas2,and cas4 was significantly enhanced in a csa3a-overexpression strain and,moreover,the Csa1 and Cas1 protein levels were increased in this strain.Furthermore,we demonstrated the hyperactive uptake of unique spacers within both CRISPR loci in the presence of the csa3a overexpression vector.The spacer acquisition process is dependent on the CCN PAM sequence and protospacer selection is random and non-directional.These results suggested a regulation mechanism of CRISPR spacer acquisition where a single transcriptional regulator senses the presence of an invading element and then activates spacer acquisition gene expression which leads to de novo spacer uptake from the invading element.
摘要:Clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats(CRISPR)loci and(C_)RISPR(as-)sociated genes(cas)constitute bacterial and archaeal adaptive immunity system against phages and other invading genetic elements.Acquisition of de novo spacer sequènces confers CRISPR-Caswith a memory to defend against invading genetic elements.However,the mechanism of regulation of CRISPR spacer acquisition remains unknown.Here we examine the transcriptional regulation of the conserved spacer acquisition genes in Type I-A of Sulfolobus islandicus REY15A.Csa3a,a MarR-like transcription factor encoded by the gene located adjacent to csa1,cas1,cas2 and cas4 cluster,but on the reverse strand,was demonstrated to specifically bind to the csa1 and cas1 promoters with the imperfect palindromic sequence.Importantly,it was demonstrated that the transcription level of csa1,cas1,cas2,and cas4 was significantly enhanced in a csa3a-overexpression strain and,moreover,the Csa1 and Cas1 protein levels were increased in this strain.Furthermore,we demonstrated the hyperactive uptake of unique spacers within both CRISPR loci in the presence of the csa3a overexpression vector.The spacer acquisition process is dependent on the CCN PAM sequence and protospacer selection is random and non-directional.These results suggested a regulation mechanism of CRISPR spacer acquisition where a single transcriptional regulator senses the presence of an invading element and then activates spacer acquisition gene expression which leads to de novo spacer uptake from the invading element.
[硕士论文] 李英俊
发酵工程 华中农业大学 2012(学位年度)
摘要:本研究利用嗜热表达载体pSeSD在冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中同源表达了RNA聚合酶亚基RpoL,采用Ni柱共纯化和凝胶过滤层析纯化到了多个蛋白质组分,通过质谱验证为RNA聚合酶复合体。同时本研究通过利用2 M/4 M/6M Urea和1 M/2 M/3 M NaCl处理纯化到的RNAP复合体,初步研究了RNA聚合酶亚基间的相互作用关系。结果表明RpoL与RpoB”,RpoA’和RpoA”之间的相互作用较其它亚基更强。根据该结果可推测在硫化叶菌中RNA聚合酶亚基的组装过程可能有别于真核生物,首先形成L-B”-A'-A”平台,其他亚基再结合该平台形成完整的RNA聚合酶复合体。另外,我们还在大肠杆菌中表达了硫化叶菌通用转录因子TBP和TFB1。本文在EMSA试验中利用上述纯化的RNA聚合酶和TBP、TFB1研究了硫化叶菌转录机器与araS基本启动子和杂合启动子(T6BRE)的相互作用,结果表明转录机器与杂合启动子(T6BRE)结合较强,与araS启动子有微弱结合。该结果在体外实验中证实了araS基本启动子不能启动转录的原因是由弱BRE造成的。
   本研究还在硫化叶菌表达载体pSeSD的基础上,构建了串联纯化标签表达载体pSeSH以及双宿主表达载体pT7SH。串联纯化标签表达载体pSeSH能够有助于提高共纯化蛋白的特异性,双宿主表达载体pT7SH能在大肠杆菌和硫化叶菌中分别利用T7启动子和araS启动子控制目的蛋白表达。本研究还利用报告基因系统分析了单链结合蛋白基因(ssb)的启动子,研究结果表明,尽管BRE位点存在缺陷,ssb基本启动子仍然具有很高活性。因此我们推测可能存在一个下游激活元件增强ssb启动子活性。最后,本研究利用微生物蛋白跨细胞膜转运的原理,在极端嗜热硫化叶菌中构建蛋白跨膜转运体系。我们将硫化叶菌胞外蛋白α-Amylase作为运载蛋白,将其基因克隆到硫化叶菌表达载体pSeSD上,构建成跨膜转运载体,并以lacS为报告基因,验证了该蛋白跨膜转运体系的可行性。
   综上所述,本研究为进一步分析硫化叶菌RNA聚合酶亚基组装模式、ssb启动子下游激活元件以及共纯化法鉴定硫化叶菌蛋白质相互作用打下了坚实的基础。
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