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摘要:哺乳动物的卵巢内有数量众多的卵细胞,是雌性生殖细胞的一个资源库.冷冻保存健康的卵巢组织,快速复苏后再原位移植到盆腔或异位移植至皮下及肾被膜等部位,有望恢复母体的生育力和维持正常激素水平.卵巢组织移植的成功否取决于移植物的大小、局部缺血持续时间、外源性抗氧化剂和血管生成因子等因素.目前,已有少数关于人类卵巢冷冻移植并成功获得活产儿的报道,也有较多动物实验得到证实.现就冷冻卵巢移植的研究进展进行综述....
摘要:文章以国家精品在线开放课程《动物遗传学》教学过程为例,对在线开放课程的教学资源、教学结构、教学观念、评价体系进行精心组织合理设计,旨在使学习活动个性化,强化自主学习能力,提高课程教学质量,为同类课程的建设提供参考....
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CSTPCD 北大核心
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摘要:"动物遗传原理育种方法"作为农业硕士专业学位(畜牧领域)一门主干课程,也是一门理论实践相结合的课程.传统的举例教学方式不仅难以满足现代专业学位教学要求,而且也难以让学生系统掌握遗传育种理论实践知识.本文在对开放式全程案例教学的内涵特点进行分析的基础上,结合"动物遗传原理育种方法"案例的教学实践,阐述了全程案例教学设计中典型案例选择、案例的课堂讲解和组织讨论、案例的课堂总结以及课程教学评价等设计技巧注意事项,为农学专业学位研究生培养过程中案例教学法的应用和推广提供一定的参考....
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要.为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus) FGF8的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能.根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到pGMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1.以qRT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的shRNA载体进行慢病毒包装.在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用qRT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率.结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为shFGF8-1、shFGF8-2、shFGF8-3,其中shFGF8-2干扰效率最佳.将shFGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×108 TU/mL、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体.对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P<0.01),PGC标记基因Cvh C-kit表达极显著上调(P<0.01).此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4d后对照组比较,FGF8低表达使CVH+PGCs比例显著增加(P<0.01).本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参调控PGCs的形成....
摘要:TEKTIN是附着于精子尾部基因丝的重要组分,对于基因丝的稳定和结构的复杂性起重要作用.Tektin3是其家族成员之一.研究采用RACE方法,获得梅山猪Tektin3基因全序列,利用生物信息学方法分析其结构和功能,采用半定量的方法研究150日龄梅山公母猪23个不同组织Tektin3基因的表达特征,并用Realtime PCR方法分析2、30、60、90和150日龄梅山公猪睾丸的表达规律.结果表明:(1) Tektin3基因全序列1 761 bp,包含5’UTR 95bp,完整的CDS序列1 473 bp和3’UTR 193 bp,编码490个氨基酸,相对分子质量为56 481.3,理论等电点为7.94.(2) Tektin3基因在睾丸中高丰度表达,在下丘脑和子宫角中表达丰度较低.(3) Tektin3基因从梅山猪60日龄开始表达,到90日龄时显著下降(P<0.05),150日龄时显著上升(P<0.05).结果表明该基因编码氨基酸除精子发生有关,可能还部分组织或器官的纤毛发生及公猪的性发育有关....
[期刊论文] 李碧春 程少泽
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北大核心
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摘要:生殖细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,通过精卵结合产生新的个体.对于具有这些特殊性质的生殖细胞,科学家们早在十年前就致力于体外培养和诱导分化成精子和卵子的研究,试图使得精子和卵子能源源不断地通过体外分化产生,这一研究一旦取得成功,将对了解生殖细胞的发生、调控机理、遗传修饰以及对临床治疗不育疾病产生深远意义的影响.而雄性生殖细胞的生长发育过程的调控研究从未停止过,其中包括内源性调控因素以及外源性活性物质,其主要涉及到关键基因、信号通路等因素的调控.本文总结鸡雄性生殖细胞分化调控的研究现状进展,阐述了关键基因对鸡雄性生殖细胞分化的影响以及鸡雄性生殖细胞生成过程中不同信号通路的调节机制,明确了参调控的关键基因和信号通路....
摘要:试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Embryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据.克隆CPED1基因全长;构建cas9/gRNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测.结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/gRNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/gRNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶.表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除....
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CSTPCD 北大核心
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摘要:“互联网+”正以其超强的资源整合运营能力,深层次地推动社会的发展变革.它的出现促进了教育方式的改革,助推了教育信息化,打破了传统教育的诸多界限.《动物遗传学》作为畜牧兽医专业类的一门重要基础课程,将“互联网+”应用于《动物遗传学》课程,不仅可提供更为丰富的共享资源,也为遗传学教学及学习提供了更好的沟通平台.文章探讨了“互联网+”背景下,尝试通过打破学习时间和空间限制,实现线上线下有机融合,应用翻转课堂教学模式,培养学习的自主性等措施开展教学改革....
摘要:[目的]探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据.[方法]采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO (web gene ontology)和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-qPCR (Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并RNA-Seq (RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8,Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖标记基因表达变化情况.[结果]在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势其在RNA-Seq中的结果一致.体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、azl、integrinα 6和integrin β1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Daz1、integrinα6和in tegrinβ1等生殖标记基因的mRNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓慢;RA+抑制剂组中,2和4d内无类胚体出现,细胞增殖缓慢,6d出现小的类胚体,8d类胚体数量少量增多,且体积稍显增大,10d类胚体开始裂解.并且经过抑制剂的掷制后,NOS2及C-kit、Cyh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖标记基因的表达量在RA诱导组、抑制剂组和RA+抑制剂组中相对于对照组均呈显著性或极显著性的下调趋势.[结论]基于RNA-Seq技术及生物信息学方法筛选出ESCs向雄性生殖细胞分化过程中精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2的基础上,通过对NOS2基因在鸡体内和体外的抑制,发现NOS2在被抑制后,ESCs向雄性生殖细胞分化的过程受到抑制.说明了精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2对ESCs向雄性生殖细胞分化过程中起到重要的调节作用....
摘要:试验分别探讨了睾酮和FSH诱导鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果.首先筛选睾酮和卵泡刺激素(FSH)的适宜诱导浓度,在RA和支持细胞的诱导基础上分别添加适宜浓度的睾酮和FSH对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果显示:睾酮和FSH的适宜诱导浓度分别为15 ng/mL和25 ng/mL,单独使用睾酮和FSH诱导均未出现类SSCs样细胞;二者联合支持细胞和RA诱导,诱导2d出现类胚体,随后类胚体体积逐渐变大,诱导12d类胚体解体出现类SSC样细胞;实时荧光定量PCR结果显示,睾酮和FSH分别支持细胞和RA共同诱导组中,Stra8表达量持续上调,integrinβ1、Dazl表达量显著上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下降趋势;睾酮的多因素诱导组中,Dazl的表达量明显高于RA和支持细胞诱导组;而FSH的多因素诱导组中Stra8的表达量相对于RA和支持细胞诱导组也显著升高.结果表明睾酮和FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但可以促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞(spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO(Gene ontology)分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸(retinoic acid,RA)以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸(piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR (quantitative real time PCR)检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现:在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组(BLANK)【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。...
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE? T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:①前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”:以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”:以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化:按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA(EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg)和脂质体2000的比例为1?0.5、1?1.0、1?1.5、1?2.0以及在最佳总mRNA脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组(P<0.05),且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组(山羊成纤维细胞正常生长组)。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。...
摘要:本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率.将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个细胞浓度,使用悬滴培养后,观察类胚体的形成效率.对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察,qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达,免疫细胞化学检测相关蛋白的表达,并进行类胚体自分化检测和核型分析.3×104 mL-1细胞浓度生成的类胚体数量最高,单个视野下可观察到约267个类胚体,且形成的类胚体大小均一,呈圆球状.qRT-PCR检测结果表明,在类胚体形成48 h内,干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达.免疫细胞化学检测显示,该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性.自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性.核型分析显示,悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型.鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×104 mL-1,且形成的类胚体可分化成3个胚层,用于体外定向诱导过程.本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础....
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北大核心 CSTPCD
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摘要:随着人类测序技术的发展成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用.基因编辑技术主要是通过在外源DNA靶位点上产生双链切口,从而诱导出同源重组修复或非同源末端连接,进而实现基因组的编辑.目前ZFN和TALEN技术被广泛运用,虽然在一定程度上获得明显的效果,但因设计复杂,成本较高,使其运用有所局限.CRISPR/Cas技术近年来凭借其高效、精确的编辑成为最新一代的基因编辑技术.本文就以上3种基因打靶技术的作用原理、应用及优缺点作简单概述,为基因编辑的实践应用提供理论基础....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用,试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4,家兔毒性试验确定其安全性,后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验,设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组,免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价;鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击,连续观察2周并计算保护率.结果显示,mLTA-VP2-CT-LA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平活疫苗免疫组无明显差别,mL-TA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组,疫苗对鸡的保护率为100%.结果表明,构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质,并能产生很好的免疫保护率,为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础....
摘要:为了解小熊猫卵巢肥大细胞分布情况,收集15只成体小熊猫的卵巢,按常规组织学技术制作组织切片.根据甲苯胺蓝染色结果,肥大细胞主要分布于血管壁卵泡动脉外膜的结缔组织中,其数量随着发情周期呈规律性变化,发情期最高,乏情期次之,妊娠期数量最少,不同时期之间肥大细胞数量差异极显著(P<0.01);阿尔新蓝-番红花红(AB-S)染色将肥大细胞可分为黏膜型、结缔组织型混合型.肥大细胞可能对小熊猫的受精,胚胎着床,妊娠有调节作用.免疫组化染色显示,小熊猫卵巢有组胺阳性细胞,这些细胞分布也是随着发情周期呈规律性变化,卵母细胞和生殖上皮细胞呈现小鼠脉管同系物(MVH)阳性反应,说明小熊猫卵巢内存在生殖干细胞....
摘要:为构建抗1型鸭肝炎病毒(DHV-1) RdRp蛋白的单链抗体(scFv)库,并淘选特异性scFv,本研究采用RT-PCR方法从DHV-1基因组中扩增RdRp基因,将其克隆于pET-32a载体中进行重组RdRp蛋白原核表达.将纯化的重组蛋白免疫小鼠,以提取的免疫鼠脾脏总RNA为模板,利用抗体轻链可变区(VL和重链可变区(VH)简并引物,经RT-PCR扩增抗体的VL和VH编码序列,由Linker序列连接,通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)扩增完整的scFv基因(VL-Linker-VH).将扩增的scFv基因克隆于pCANTAB5E载体中构建噬菌体scFv文库,利用纯化的重组RdRp蛋白开展4轮吸附-洗脱-富集以淘选抗RdRp的ScFv;最后对淘选到的阳性ScFv进行可溶性表达,以ELISA方法检测其免疫结合活性.结果显示,获得了7株具有良好抗原结合活性的ScFv.淘选到的DHV-1 RdRp 特异的基因工程ScFv,为鸭病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基础....
摘要:小熊猫栖息于喜马拉雅横断山脉,是亚洲濒危物种.中国的小熊猫谱系已登记圈养小熊猫个体968只,现有存活个体355只(2013年),然而,现有谱系中存在部分信息不明确的问题.为此,我们选择19对小熊猫特异性引物对41只圈养小熊猫进行微卫星扩增,并分析其亲缘关系.将获取的亲子鉴定结果,结合种群原始记录信息,利用Pedigraph软件构建福州圈养小熊猫的种群遗传谱系图.结果表明:在母子关系确实的情况下,19个基因座位的联合父权排除概率为0.99999968;利用6个已知双亲的后代检验19个基因座位的可信度,后代双亲的基因型完全符合孟德尔遗传定律,表明19个基因座位能有效确认小熊猫的亲权关系.应用19个微卫星标记成功地为15个后代找到了生物学父亲.尽管一些雌性个体在繁殖期有多重交配的行为,亲子鉴定的结果显示同一窝小熊猫均来自单一父权.基因型比对结果表明7对双胞胎均属于异卵双生子.福州种群的后代中除#920和#921外,其余均源于#487或#898两只雄性,表明不同个体参繁殖的机会不均等.因此,利用现代繁殖技术,加强濒危野动物种群管理,科学制定繁殖计划具有积极的现实意义....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测.同时用Oct4启动子-1516~+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性.结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游-1516~+30 bp,基本活性区域为-238~+30 bp;在-1516~-946 bp、-615~-96 bp区域存在正调控元件,在-1936~-1516 bp、-946~-615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μtmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;-1516~+30 bp片段能够启动GFP的表达.研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础....
摘要:本研究利用精原干细胞介导法体内转染重组载体pVITRO2-Mx-NA以生产抗病转基因鸡.采用睾丸注射法将脂质体包裹的线性化质粒通过随机打点注射入公鸡睾丸,采集25、50、60、70d后试验公鸡的精液,提取基因组DNA,采用常规PCR检测外源Mx-NA联合基因的整合;转染后60d采集阳性公鸡精液人工授精母鸡,采用PCR和Western blot方法检测后代血液中外源NA-Mx联合基因的表达情况.结果表明:PCR检测证实外源Mx-NA联合基因已在精子基因组中表达,精液PCR阳性率为33.33%(2/6),且能通过体外受精在后代中检测到,后代PCR检测的阳性率为31.43%(11/35),Western blot检测F1代阳性率为28.6%(10/35).以上结果证明外源Mx-NA基因能稳定整合到鸡的基因组中,表明睾丸注射法是一种操作简单、有效的制备抗病转基因鸡的方法....
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