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摘要:氮杂螺环酸毒素(azaspiracids,AZAs)隶属八大类海洋贝类毒素,为一类含氮且具独特螺环结构的聚醚类毒素.采用液相色谱-三重四级杆复合离子阱质谱,研究了分离自中国近海的1株氮杂螺环酸产毒藻腹孔环胺藻(Azadinium poporum,AZDY06)所产氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的蓄积、分布和生物转化机制.通过将栉孔扇贝暴露产毒藻的方式,分析扇贝内脏团、裙边、闭壳肌和其他可食组织4个组织部位的AZAs及其代谢产物分布,研究栉孔扇贝对毒素的代谢机理.结果表明,AZDY06主要产生AZA2毒素,单细胞产毒能力最高为(7.05±0.52)fg/cell;扇贝12 h内摄食5×107个产毒藻细胞后,体内AZAs毒素含量已超欧盟安全限量,达165.3μg AZA1eq/kg,蓄积效率为78.2%.AZAs毒素在扇贝各组织间分布存在显著差异:内脏团>其他可食组织>外套膜>闭壳肌.AZA2在扇贝中潜在转化方式为羟基化、去羧基化和氧化,共生成4种代谢产物:AZA6、AZA12、AZA19和AZA23,其中AZA19为最主要代谢产物,约占总毒素40%,其他代谢产物含量较低.本研究证明中国近海分布氮杂螺环酸产毒藻毒性危害较强,建议有关部门加快制定AZAs限量标准....
[专利] 发明专利 CN201710038090.7
青岛科技大学 中国水产科学研究院黄海水产研究所 2017-05-10
摘要:本发明公开了一种原多甲藻培养基和培养方法,培养基包括下列重量的组分:NH4NO3,20‑100mg;CO(NH2)2(尿素),20‑60mg;KH2PO4,1‑10mg;NaHCO3,100‑800mg;MnCl2·4H2O 15‑50g;FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁),10‑30mg;VB12,1×10‑5‑1×10‑3mg;VB1,50‑200mg;KCl,0.5‑5mg;Na2EDTA 10‑15g;壳寡糖0.2‑5g(分子量1500‑2000Da)海水1000mL。原多甲藻培养基的培养方法,包括如下步骤:第一阶段:三角烧瓶培养;第二阶段:矿泉水桶培养。本发明给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方,可提高原多甲藻毒素产量并降低养殖成本。且采用矿泉水桶培养原多甲藻与传统的露天开放水泥池式扩大培养相比,成本低,不易污染,易于操作,大大降低了工作量,使原多甲藻生长速度大幅度提高,培养周期缩短。
[硕士论文] 李清云
海洋化学 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:海洋水体的富营养化导致赤潮频繁暴发,有害赤潮藻所产毒素在贝类体内富集形成贝类毒素,严重危害消费者的身体健康,阻碍水产品对外贸易的发展,成为影响贝类产业可持续发展的瓶颈之一。本文以新型贝类毒素氮杂螺环酸毒素为研究对象,建立多种AZAs毒素的Q-Exactive高分辨质谱检测方法,同时在实验室内对产自我国沿海的一株氮杂螺环酸产毒藻AZDY06进行单种培养并对其产毒能力进行了评估。随后,应用该产毒藻对栉孔扇贝进行暴露实验来研究氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的代谢轮廓,及其对栉孔扇贝组织结构和生理的胁迫作用等方面进行了实验研究。论文的主要内容如下:
  (1)采用Q-Exactive高分辨质谱,在液相色谱-串联质谱法基础上进一步创建了AZA毒素高分辨非定向定性筛查和低分辨目标物定量筛查检测方法,对蓄积代谢试验样品进行综合分析,根据化学分子式计算各AZAs的精确质量数,精确筛查到了AZA2在贝类蓄积代谢过程产生的四种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19和AZA23),并使用液相色谱-串联质谱对实际阳性样品进行了定量检测,达到了同时精准定性和精确定量的要求,适用于氮杂螺环酸毒素代谢物质的的筛查分析工作,为进一步完善我国水产品中贝类毒素的监控体系提供可靠的工作基础和技术支撑。
  (2)将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于三种产毒藻不同生物量模式下模拟赤潮爆发时初期、中期和后期海洋环境过程,通过比较毒素组分、各组织器官中毒素的蓄积及代谢转化特异性,研究氮杂螺环酸毒素(Azaspiracid,AZAs)在栉孔扇贝体内危害形成的过程。结果显示,分布于我国南海海域的氮杂螺环酸产毒藻(A.poporum,AZDY06株),其生长及产毒性状稳定,产毒能力较强,主要产生AZA2毒素,单细胞产度能力一般为7.05±0.52fg/cell;投喂低生物量产毒藻组扇贝体内有共有三种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19)产生,中生物量和高生物量实验组有四种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19和AZA23)产生,说明贝类摄食产毒藻生物量的大小影响代谢产物组分的转化过程;中生物量和低生物量组在暴露阶段的变化趋势相似,都是在蓄积阶段呈现迅速上升的趋势,达到最高点随后呈现总体下降趋势,而高生物量组在蓄积阶段呈现迅速上升的趋势,在蓄积前期既已达到峰值后呈急剧下降趋势,随后缓慢增加直至暴露结束后,比较而言,各实验组对AZAs毒素蓄积能力由大到小顺序为:中生物量组>高生物量组>低生物量组,其中以中生物量组蓄积能力最强。实验数据初步探究了AZA2在栉孔扇贝体内的代谢转化机制,为后续实验奠定基础。
  (3)前期实验表明,高生物量产毒藻暴露实验会增加栉孔扇贝体内代谢产物的组分种类和各组分的含量,但是随之也会加重对扇贝的毒害作用,会降低扇贝对氮杂螺环酸毒素的蓄积能力,暴露时间越长,扇贝对毒素的蓄积代谢能力越弱。所以将栉孔扇贝(Chlamys farreri)直接暴露于更高生物量产毒藻,同时缩短暴露时间。结果表明,栉孔扇贝对该产毒藻具有较强摄食能力及AZAs蓄积能力,扇贝在12h内摄食5×107cells产毒藻细胞后,体内AZAs毒素含量已超欧盟安全限量,达165.3μg AZA1 eq/kg,蓄积效率为78.2%;AZAs毒素在扇贝各组织间分布存在显著差异:内脏团>鳃>外套膜>闭壳肌,内脏团中毒素组份最多且AZAs毒素含量最高,为该毒素在栉孔扇贝体内蓄积代谢的靶器官;AZA2在扇贝中潜在转化方式不同,包括碳键位的羟基化、去羧基化和氧化等作用方式;暴露期间共生成4种代谢产物:AZA6、AZA12、AZA19和AZA23,其中AZA19为最主要代谢产物,约占总毒素40%左右,其他代谢产物含量较低,因此像AZA19这种持久性代谢产物,应成为我国AZA限量标准制定的潜在考虑对象。本研究证明我国近海分布氮杂螺环酸产毒藻毒性危害较强,建议加快制定AZAs限量标准。
  (4)暴露于三种不同生物量模式下的栉孔扇贝在暴露实验初期,内脏团和鳃组织内的抗氧化防御系统中的氧化还原酶被激活,MDA含量增多,脂质发生过氧化,相应的GSH-PX和POD酶活力均增强,粒细胞分泌的ACP、POX活力增强。综合AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织的超微结构的损害以及引起的组织中氧化还原酶的激活作用,可共同为AZAs胁迫下贝类的组织毒理学指标的确立提供理论依据。实验结果显示:暴露实验过程中,在AZAs的作用下栉孔扇贝内脏团和鳃组织的超微结构均出现了病理变化,内脏团的肠上皮细胞空泡化,细胞核萎缩变形,严重时细胞坏死裂解,且损伤程度随暴露毒素生物量的增加而加重;暴露前期,鳃的柱状上皮细胞中线粒体和溶酶体增多且聚集,后期上皮细胞肿胀破裂,粘液细胞大量释放粘液颗粒。通过暴露实验检测内脏团和鳃组织中抗氧化防御系统中氧化还原酶的变化,同时观察了AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织超微结构的毒理学作用进一步研究AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织的毒理学胁迫作用。
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