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[博士论文] 李泽卿
园林植物与观赏园艺 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:二球悬铃木(Platanus acerifolia)是我国城市绿化中最为重要的物种之一。其冠大荫浓、生长迅速、适应性较强、具有净化空气的能力,被人们称之为行道树之王。二球悬铃木被广泛种植于全球的各个城市,在园林建设中占据不可替代的作用。然而,二球悬铃木果实成熟之后裂果所带来的毛絮,严重影响到了城市的环境和人们的身心健康。近些年来,有很多的科研工作者在突变育种、枝条修剪等方面做了很多的研究,但都没能从根本上解决二球悬铃木落果飞毛的问题。随着植物分子生物学技术的发展,尤其是在利用基因工程创造不育植株中取得了很大的突破,为培育无球二球悬铃木带来了新的希望。
  自ABC模型提出以来,研究人员对花器官发育的基因调控网络做了深入分析,使花发育相关的研究从形态描述及生理层次,深入到了分子调节水平。随着对二球悬铃木开花相关基因的克隆,对其成花机理的了解也越来越透彻。深入了解这些花器官形成基因的调控机理,可以更好地将这些遗传资源应用到二球悬铃木等园林植物的育种中。本课题以二球悬铃木为实验材料,采用了TAIL-PCR的方法分离了二球悬铃木中花发育B类两个基因的启动子序列,采用生物信息、启动子截短、GUS蛋白染色和表达分析等手段,研究了启动子的表达活性和部位。后期采用启动子驱动毒性基因BARNASE的办法,获得了不开花的烟草转化植株。同时本课题还克隆了D类STK基因和其启动子,并对其功能和表达特征做了分析。通过本课题的研究更深入的了解了二球悬铃木花发育相关基因的规律,也为通过基因工程的方法改良二球悬铃木品种获得不育植株奠定了基础。主要的研究结果如下:
  1、选取了二球悬铃木花发育相关B类同源基因AP3和PI为对象,根据已知的CDS序列,采用TAIL-PCR的方法,分离克隆这两个基因起始密码子上游的序列。通过构建中间载体测序等方法验证后,利用生物信息学的手段对启动子进行了顺式元件预测。分析发现,PaAP3启动子(pPaAP3)与PaPI启动子(pPaPI)序列除了含有核心启动子序列外,还含有一些组织特异性元件,例如开花相关的MADS家族基因和干细胞决定基因WUS等作用位点。推测这些启动子很有可能具有组织特异性表达的特点。
  2、根据启动子顺式元件预测结果,将两个启动子截短成不同长度片段(pPaAP3-p1至pPaAP3-p8,pPaPI-p1至pPaPI-p5),分别驱动GUS基因构建表达载体转化烟草。通过启动子截短加组织化学染色的方法,发现PaAP3启动子在2900bp片段(pPaAP3-p8驱动下,GUS基因表达较强,在花四轮器官中均有表达,且在营养组织茎和叶中均有一定量的表达。而PaPI启动子则在2800bp长度时(pPaPI-P5)具有最高的表达量与最好的组织特异性,其表达主要集中在花瓣、雄蕊和雌蕊中,营养器官叶片中仅有极微量的表达,茎中则有一定的表达。后续又通过RT-PCR的方法证实了GUS蛋白染色结果。该结果显示,启动子pPaAP3和pPaPI均具有启动基因表达的作用,但基于PaAP3与PaPI两个基因的表达模式不一样,启动子pPaPI更适合用于遗传改良中不育材料的创建。
  3、结合启动子缺失和GUS蛋白染色实验结果,分别选择了pPaAP3-p8和pPaPI-p5两个不同长度的片段分别融合BARNASE基因,转化烟草。结果显示pPaAP3-p8∷BARNASE的烟草转化植株中,仅有少量阳性植株能存活至开花期,且存活烟草均不能产生正常形态的花蕾,植株顶端分生组织出现褐化枯萎。pPaPI-p5∷BARNASE的烟草转化植株营养生长正常且侧枝增多,最终能形成畸形花,但形成花蕾相对对照晚60d左右,且花器官缺失内三轮,仅残留萼片,败育花蕾早期脱落。RT-PCR结果显示,BARNASE基因在pPaPI-p5∷BARNASE植株非生殖器官中的表达要低于pPaAP3-p8∷BARNASE转化植株。这些结果和GUS蛋白染色分析结果一致,显示启动子pPaPI可能更适合用于创建二球悬铃木不育植株。
  4、采用保守区段扩增,结合RACE技术手段克隆了二球悬铃木中D类STK基因(PaSTK)。研究了PaSTK基因的保守区段,比较了PaSTK基因与其它物种中同源基因的差异,分析了它在物种进化中的地位。并利用qPCR研究STK基因在二球悬铃木不同组织中的表达量分析,发现其在4月份雌花序与6月份球果中有显著性的上调表达,而在营养组织和其他时期的花序,球果中表达量较低。该研究为更好了解雌雄异花木本植物的开花分子机理奠定基础。
  5、与克隆B类基因启动子采用类似的方法,根据克隆到的PaSTK基因信息,采用TAIL-PCR的方法,分离克隆该基因起始密码子上游的启动子序列(pPaSTK)。然后将该启动子驱动GUS基因转化拟南芥。结果表明,GUS蛋白在所有营养器官与花四轮器官中均没有表达或极低量表达,而在拟南芥种子和果荚中则有大量表达。将该启动子融合BARNASE基因转化拟南芥,发现转化植株营养生长不受影响,能形成正常的花朵与荚果,解剖发现荚果仅有外层表皮,没有种子发育形成。该研究证实pPaSTK仅在胚珠中启动基因表达,同样能够应用于基因工程构建二球悬铃木不育系。
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