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[硕士论文] 李慧真
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:蓝细菌中有一种能够捕捉光能的色素蛋白,与植物、细菌光敏色素具有很高的相似性,我们将这种蛋白称作蓝细菌光敏色素。存在于念珠藻PCC7120中的光敏色素AphB,具有PAS和GAF结构域,并且PAS结构域上第17位半胱氨酸的巯基(-SH)可以与发色团胆绿素A环上的C3原子形成硫醚键,使蛋白与BV共价结合;与此同时GAF结构域通过空间结构的作用将BV紧紧包裹在蛋白内部,使色素与脱辅基蛋白紧密结合。由于存在色素小分子,色素蛋白具有特征光谱,AphB重组BV的最大吸收峰在697nm,最大荧光峰在720nm,该光谱处于活体组织可视化光学成像范围(650-1100nm)内,因此AphB具有开发为近红外荧光生物探针的潜力。
  本文主要是将AphB与已报道的细菌光敏色素的PAS-GAF的氨基酸序列进行序列比对,总结得出保守的氨基酸位点,从而将AphB进行定向改造,进化出理化性质良好的诱变体,用于体内荧光探针的开发。在实验室研究的基础上,已知AphB(7-321/A288 V)对光稳定增强的突变体,根据得出的保守氨基酸位点,对AphB的207位天冬氨酸(Asp)进行定点突变,分别突变成丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe),研究该突变位点对蛋白活性的影响,筛选活性良好突变体。基于这些定点突变体,我们使用易错PCR和DNA shuffling的方法对蛋白进行改造,构建诱变体文库并使用高通量仪器Qpix420进行诱变体初筛,用多功能酶标仪和荧光光谱仪进行复筛,将筛选到的突变体在大肠杆菌中进行蛋白表达,光谱检测,分析突变体蛋白的理化性质。用SWISS-MODEL网站进行在线同源建模,模板为RpBphP2(PDB∶4E04),同时通过T-coffee软件在线比对分析突变氨基酸位点,并用Pymol软件标记了蛋白三维结构中的突变位点。筛选得到的9个诱变体中,最高的荧光量子产率提高了160%,最高的摩尔消光系数提高了130%,最大的相对分子亮度提高200%,对AphB的优化为之后蓝细菌光敏色素类荧光蛋白的改造提供参考。
  此外,有研究表明,除蓝细菌光敏色素外,藻蛋白类荧光蛋白如smURFP可以结合细胞内的胆绿素BV,并且具有很高的稳定性和较强的荧光亮度,这对于开发近红外荧光探针来说很重要。而念珠藻PCC7120藻胆蛋白中核膜连接蛋白ApcE(50-240/△77-153)可以结合藻胆色素PCB、PEB,但是并不能结合胆绿素BV,因此我们尝试筛选出可以结合BV的突变体用于近红外荧光探针的开发。首先对ApcE(50-240/△77-153)进行定点突变,找到活性更好的诱变体,然后以此诱变体作为模板,对蛋白进行随机突变,构建突变体文库,并用高通量仪器Qpix420进行诱变体初步筛选,将筛选得到的突变体在大肠杆菌中进行蛋白表达提纯,光谱检测,并分析其理化性质。目前我们得到能结合色素BV的突变体,但蛋白有待于进一步的优化。对ApcE的优化可以为之后藻胆蛋白类荧光蛋白的改造提供参考。
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