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[硕士论文] 李恩杰
森林保护学 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:松材线虫(Pine Wood Nematode,PWN)是松材线虫病(Pine Wood Nematode Disease,PWND)的主要病原,能够对松属植物造成毁灭性的危害,也是目前世界性的检疫有害生物。因松材线虫隐蔽性强,而直接以PWN为靶标进行生物防治的难度较大。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是全球开发应用最为广泛的微生物杀虫剂之一,其部分菌株的发酵液具有杀PWN活性。伊氏杀线真菌(Esteya vermicola, Ev)是首次在PWN里发现的内寄生真菌,该真菌产生的新月形孢子对PWN具有侵染和致死活力。本研究拟从杀线虫Bt菌株的筛选入手,研究高毒力杀线虫Bt菌株发酵液的毒力稳定性以及Bt与Ev对PWN的联合毒力。旨在为以后利用Ev和Bt联合防控PWN提供一定的理论依据和技术支持。
  通过采用直接触杀法对Bt发酵液进行PWN毒力测定。结果显示,从4个菌株中筛选出高毒力的菌株D,其发酵液处理PWN24h的死亡率达到100%,杀PWN速度也较其它菌株快,处理8h后,PWN死亡率达到70%以上。通过毒力稳定性实验发现菌株D的发酵液对蛋白酶K稳定,耐碱、不耐强酸,对温度不敏感,且在4℃保藏50d后,该菌株发酵液活性并未下降,确定致病因子可能为β-外毒素。PCR鉴定结果显示菌株D的16SrDNA片段与Bt KNU-07的相似度为100%。
  室内使用Ev孢子悬浮液与Bt发酵液处理PWN,通过PWN的形态变化、死亡率及死亡速度3个方面测定Ev与Bt联合毒力作用。结果表明,经过Ev孢子悬浮液处理过的PWN出现内容物渗漏,体腔收缩、弯曲、断裂的现象;高浓度的Ev孢子悬浮液与Bt发酵液联合处理PWN可以明显地提高PWN的死亡率;当Ev孢子悬浮液浓度为2.5×108cfu·mL-1、Bt发酵液稀释3倍时杀PWN效果最好,可以达到100%;联合处理的PWN死亡速度较快,随着联合处理时间的延长,死亡率呈上升的趋势。
  温室测定Ev孢子悬浮液与Bt发酵液联合毒力。结果表明,利用高浓度Ev孢子悬浮液与稀释3倍Bt发酵液混合后,注射感染松材线虫病的油松(Pinus tabuliformis Carrière)树苗,发现树苗存活率比单独使用二者的都要高。Ev与Bt联合后,预防组与防治组的效果差异不显著(P<0.05),而在单独使用高浓度Ev孢子悬浮液处理时,预防组的树苗存活率比防治组的高,稀释3倍的Bt发酵液处理的则防治组的树苗存活率比预防组高。
摘要:对北京九龙山自然保护区野生欧李营养成分进行分析,为其开发和利用提供科学依据.采用原子吸收光谱法、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)法等分析欧李不同器官(根系、枝条、叶片、果肉和果仁)的多糖、蛋白质、Ca、Fe、Zn、Se含量及脂肪酸、氨基酸组成,并采用国际通用标准对其蛋白质营养价值进行评价.结果表明:欧李5种营养器官中,根系粗多糖含量为7.39 %,显著高于其它器官.叶片中钙和铁含量丰富,钙含量(28.62 g/kg)是果肉和果仁中钙含量的13.09倍~18.49倍,铁含量(169.51 mg/kg)是果肉和果仁中铁含量的9.28倍~10.09倍.依据通用标准,叶片和枝条均达到优质蛋白源标准.欧李果仁中油脂含量丰富,其中油酸和亚油酸含量分别为25.40 %和12.52 %,不饱和脂肪酸总含量超过90 %,并且果仁中锌、硒、必需氨基酸、总氨基酸含量均显著高于其它器官.由此可知,九龙山野生欧李叶片、枝条钙和铁含量很高,且为优质蛋白源;果仁富含不饱和必需脂肪酸和硒等营养,油脂价值较高;果肉可食用,根系具有潜在药用价值....
摘要:松材线虫是松树萎蔫病的主要病原,为了筛选到具有较高杀线虫活性的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis菌株,采用直接触杀法对苏云金芽胞杆菌发酵液进行杀线虫活性以及稳定性的检测,并对筛选出的高活性菌株通过扩增16S rDNA片段进行菌株的鉴定.结果表明,4个菌株中具有最高活性的菌株D发酵液处理松材线虫8h的死亡率超过70%,24 h其死亡率达到100%;在温度为-20、25、40、60、80和121℃条件下处理的菌株D发酵液,其对松材线虫的毒力都在85%以上;在pH 5.0~10.0时,菌株D发酵液对松材线虫的毒力都在85%~94%,并无显著的差异;将菌株D发酵液进行蛋白酶K处理后,其对松材线虫的毒力仍在98%以上;在4℃环境下保存50 d,菌株D发酵液的毒力没有明显下降.通过16S rDNA 1.5 kb片段的序列分析,初步得出菌株D可能是苏云金芽胞杆菌KNU-07.可见,菌株D发酵液具有耐热、耐储藏和对蛋白酶K稳定的特性,是一株具有开发潜力和应用前景的高毒力菌株....
摘要:美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nudeopolyhedroviurs)是一种对美国白蛾高效、 对环境无污染、对天敌及非靶标生物安全的生物杀虫剂.建立高效、 快速的定量检测方法对该病毒持续控制美国白蛾具有重要意义.将polh基因构建到pGEM-T-easy载体上,制备标准品质粒,构建标准曲线,对未知样品DNA进行定量PCR检测,根据标准曲线计算样品中美国白蛾核型多角体病毒含量.提取感染病毒不同时间段的美国白蛾幼虫基因组DNA,根据已建立的方法检测并计算每克样本病毒的基因拷贝数.利用TaqMan探针法成功建立了该病毒荧光定量PCR检测方法.以取食3.0×106 OBs/mL浓度病毒的美国白蛾幼虫基因组DNA为模版,进行荧光定量PCR,病毒在幼虫体内的含量在第5天开始出现大幅增长趋势,第6天时达到最高.TaqMan探针法实时荧光定量PCR能简便、 高效、 快速的检测出大量未知样本基因组DNA中病毒基因的拷贝数,为研究该病毒的传播和流行规律提供了可行的监测方法....
摘要:[目的]根据Ikdea对HycuNPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因.[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白.[结果]重组质粒pGEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功.通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与pGEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38.2 kDa.优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1.0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高.[结论]成功构建了pGEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础....
摘要:[目的]探究伊氏杀线真菌与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对松材线虫的联合毒力.[方法]使用Esteya vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液处理松材线虫,通过线虫的形态变化、死亡率及死亡速度3个方面测定E.vermicola与Bt联合对松材线虫的影响.[结果]经过E.vermicola孢子悬浮液处理过的线虫会出现内容物渗漏,体腔收缩、弯曲、断裂的现象;高浓度的E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液联合处理松材线虫可以明显地提高线虫的死亡率,最高可以达到100%;联合处理的线虫死亡速度较快,随着处理时间的延长,死亡率会一直呈上升的趋势.[结论]应用这两种生防微生物在合适的浓度下混配能够在较短时间内提高松材线虫的死亡率....
[专利] 发明专利 CN201610587236.9
摘要:本发明公开了一种美国白蛾核型多角体病毒水分散粒剂及其制备方法和应用,该水分散粒剂含有美国白蛾核型多角体病毒、高岭土、甘油和氯化钠;所述美国白蛾核型多角体病毒的含量为5.0×1010‑2.5×1011PIB/g,以100重量份的所述水分散粒剂为基准,所述高岭土的含量为80‑90重量份,所述甘油的含量为1‑7重量份,所述氯化钠的含量为0.3‑1.0重量份。该水分散粒剂相对于传统的液体制剂具有有效成分高、加水后崩解性好、对环境污染小、杀虫效果好的优点,且便于储存和运输,是一种理想的绿色环保型制剂。
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