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摘要:目前,抗体Fab片段在癌症、病毒感染和炎症等疾病的诊断治疗中越发重要,占抗体市场份额逐渐上升.相对于全长抗体,抗体Fab片段具有无须N糖基化、可用原核系统进行表达、分子小、免疫原性低等优势,使之成为研究的热点.大肠杆菌由于遗传背景清晰、使用广泛、生产成本低,因而常作为原核表达宿主.本文综述了大肠杆菌系统抗体Fab片段产量低的解决方法、Fab抗体的临床应用,并结合当前研究现状展望了Fab抗体生产的研究方向....
[专利] 发明专利 CN201810364192.2
安徽大学 2018-09-28
摘要:本发明公开了一种高效分泌表达抗VEGF‑Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法,其保藏编号为CCTCC M2017823,本发明通过RED重组无痕敲除的方法,删减了E.coliDH1基因组中11个非必需区,最终删减了总基因组的10.59%,确定了最优的Fab表达载体组合为pelB+HC+pelB+LC,通过无痕敲除方法在DH11基础上同时敲除prc和degp蛋白酶基因,与原始宿主DH11相比,有更高的分泌Fab的能力,最终提供了高产菌株DH11‑prc‑degp。
[硕士论文] 李巧玲
生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:目前,抗体片段Fab在治疗人类多种疾病(如癌症、病毒感染、炎症等)方面起着重要作用。由于其缺少糖基化的Fc区,因此并不需要进行糖基化修饰。此结构特点使得Fab可在大肠杆菌中进行活性表达。Escherichia coli作为宿主菌株的突出优势在于低成本、生长快、易控制,在短时间内可以获得高产量,因此,已逐渐成为生产抗体的中坚力量。但是,在E.coli中生产抗体片段Fab的主要限制因素在于Fab的产量较低,原因主要是Fab易在胞质中错误折叠、聚集,形成无生物学活性的包涵体,且宿主菌中含有多种蛋白酶,对Fab有一定的降解作用等。因此,为提高抗体产量,可以从表达载体、宿主菌株、分子伴侣及折叠酶等几个方面着手,以期达到理想目标。
  本课题从三方面对Fab的表达进行了优化:1)在实验室前期工作基础上,以E.coli DH11T7为宿主菌株,通过构建不同的Fab表达载体,最终提高Fab在E.coli中的产量;2)在1)工作的基础上,通过共表达多种分子伴侣,进一步提高Fab在E.coli中的产量;3)在E.coli周质蛋白酶缺陷菌株DH11-ptr-degp(以下简称86D)的基础上,对其基因组上spr(extragenic suppressor,抑制prc基因缺陷造成的菌体过早裂解)基因H145A位进行单个氨基酸突变,获得突变菌株86D-Mspr,同时共表达优势Fab表达载体及分子伴侣,最终通过发酵实验,提高Fab在E.coli中的产量。
  对于Fab表达载体的构建,主要对信号肽进行优化。尤其是重链信号肽DsbA及STII,通过改变信号肽翻译起始区(translation initiation region,TIR)强度,将获得的13个重链片段分别与PelB-LC连接至pET-3b载体骨架,经ELISA分析获得了Fab最优表达载体的组合DsbA8+HC+PelB+LC(pET-DH8PL),总产量约14mg/L左右。通过进一步构建单一分子伴侣表达载体及多个分子伴侣表达载体,能够在一定程度上改善Fab在E.coli中的分泌表达,尤其当以p15c-FkpA-SurA组合时,Fab产量可达到20mg/L左右,产量提高了30%。将宿主菌株由E.coli DH11T7替换为E.coli周质蛋白酶缺陷菌株86D时,抗体片段Fab的产量可提高20%左右。
  E.coli属于原核表达系统,其发酵工艺相对简单,对表达宿主的大规模培养是为了获得大批量的抗体蛋白。本课题在实验室所构建的Red无痕敲除法的基础上,用类似的方法完成了对E.coli86D spr H145A单个氨基酸的突变,获得了基因组突变菌株86D-Mspr。第一步,将构建的供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB与辅助质粒pAAICDGBE共转入E.coli86D中,在L-阿拉伯糖的作用下,诱导表达Ⅰ-CreⅠ核酸内切酶和Red重组酶。Ⅰ-CreⅠ酶切割供体质粒上的左右同源臂及Cm抗性基因,并在Red重组酶的作用下,进行同源重组,最终在E.coli86D基因组上成功整合Cm抗性基因。第二步,将辅助质粒SN3K转化至第一步含Cm抗性基因的E.coli86D中,同样在L-阿拉伯糖作用下,诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶和Red重组酶。在Ⅰ-SceⅠ酶作用下,将基因组上的Is-Cm片段切除,同样在Red重组酶的作用下,左右同源臂与染色体发生同源重组,从而获得基因组突变菌株86D-Mspr。最终对其进行初步发酵工艺研究,在3L发酵罐中抗体片段Fab的产量可达到72mg/L左右。本工作为进一步提高抗体Fab产量打下了基础。
摘要:唐五代笔记小说内容广泛驳杂,治史者可以从中挖掘资料,考察到这一时代的风俗、逸事等.唐代儿童的日常生活也尽收其中,一则则故事中寥寥几字的描写便向我们刻画出当时的儿童在社会风俗、家庭教育、科举制度、娱乐游戏中所扮演的角色,受社会影响下的儿童更具有这一历史时期的独有特点....
[硕士论文] 李巧玲
历史学专门史 安徽大学 2011(学位年度)
摘要:在唐代政治稳定、经济繁荣、国内形势一片祥和的形势之下,儿童受到人们较多关注。儿童的相关问题是一个历史性话题,先秦以来对儿童教育、健康、法律地位等问题的关注在唐代得到更加充分的发展。
   通过对丧服的规定、唐代法律行为、国家经济行为、行冠、笄礼时间以及唐代男女婚龄的考察,本文以16岁左右为唐代儿童年龄上限。
   秦汉以来的医书已关注到儿童身体,至唐代,在儿童养育方面人们积累了丰富的医学知识和养生宣忌。文章从唐代以及唐以前医学书籍着手,论述唐代儿童养育问题,紧扣医疗知识和技术在儿童养育的运用,详细介绍医学中对儿童养育各个方面的指导,其中包括孕妇禁忌、断脐、新生儿护理、选择乳母、幼儿命名等等内容。针对前代溺杀婴儿导致儿童夭折的现象,结合诗文、墓志铭等材料,指出唐代并不存在明显因禁忌等其它原因而溺杀儿童的现象,唐代儿童似多为自然死亡。
   历朝历代对于儿童的刑事责任能力划分不同:秦律以身高为确定行为人刑事责任的标准,不满6尺者不追究法律责任;汉朝儿童被追究刑事责任大体以八岁为起点;至唐代划分虽然较为详细,但下限仍在七岁以上。唐律对儿童地位保障主要体现在延迟处罚孕妇、儿童缘坐、儿童的收养与过继三方面。唐律有关儿童被教唆犯罪、拐卖儿童现象、非婚生子女的财产继承问题以及卑幼嫁娶等事例的相关规定一定程度上保障了儿童的合法权益。考虑到唐代作为封建王朝的特性,这种保护仍是一种有限度的保障,其前提是维护尊卑长幼和社会等级,并不是绝对平等、充分考虑到儿童权益的法律。
   宫廷儿童可分为皇室儿童和下层儿童。他们在生育、抚养、教育、游戏方面有同有异。皇室子孙显赫的身份从出生开始就已突显,吃、穿、用、行无不彰显其尊贵的地位;不同等级的儿童为其不同的目的,接受相应的教育。皇室子孙为人中龙凤,诗、书、礼、乐样样精通;下层幼奴刻苦学习,他们掌握各项技能仅仅是取悦主上的手段。宫廷中的儿童游戏,以卑贱儿童表演、尊贵儿童欣赏为主要特点。上层贵族儿童与下层儿童之间的差异是社会等级造成的,社会等级划分给儿童造成了不可忽视的影响。
   总而言之,唐代儿童这一特殊群体的发展变化,同唐社会发展变化紧密相关。儿章的各方面健康成长,是由其社会活动的稳定性决定的。大量医学书籍收录、记载治疗儿科的医方正说明了唐代儿童的发育成长日益引起社会重视;政府性的法律、法规更详细规定了儿童权益的相关问题,虽然这一权益是建立在保障尊长核心地位和社会等级秩序基础之上的,但也足以使我们看到唐代较前朝的进步之处。唐代对于儿童的知识、观念和法令奠定了此后儿童发展的基础。
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