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中国疾病预防控制中心
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[硕士论文] 李小红
免疫学 中国疾病预防控制中心 2003(学位年度)
摘要:血吸虫病疫苗的研制工作已经开展了近半个世纪,迄今为止没有取得突破性进展.世界卫生组织曾经公布的被认为最有希望的六种曼氏血吸虫的候选抗原目前已全部完成试验,结果并没有达到预期的效果.而其他途径生产的抗原分子试验结果也同样不理想.日本血吸虫方面,研究进展相对缓慢一些.寻找新的候选抗原迫在眉睫.目前看来照射致弱尾蚴仍然是抗血吸虫感染最有效的免疫原,它不仅能诱导啮齿类动物产生较高的保护力,而且免疫灵长类动物如狒狒也能取得同样效果.由于其来源、制备以及安全性等问题,照射致弱尾蚴不可能直接应用于人群或牲畜的大规模免疫预防.因此克隆并表达其中起主要作用的抗原分子,制备核酸或重组疫苗才有可能实现大量生产并保证其安全性,同时又能保持其原有的免疫原性.该研究利用紫外线致弱童虫免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,发现了若干编码具有保护作用的Sj抗原基因,并对其中的Myosin部分重链基因进行了研究.
摘要:东方田鼠(Microtus fortis)[1]亦称米氏田鼠(Microtus michnoi kastschenko, 1910)或沼泽田鼠、远东田鼠、大田鼠、长江田鼠及湖鼠.属于啮齿目,仓鼠科,田鼠亚科,田鼠属,在我国分布甚广.我国的东方田鼠大致可分为5个亚种:分布于陕西、甘肃的指名亚种(M.fortis fortis Büchner,1889)、分布于长江中下游的长江亚种(M.fortis calamorum Thomas,1902)、分布于东北等地的黑龙江亚种(M.fortis pelliceus Thomas, 1911)和辽宁亚种(M.fortis fortis dolichoephalus Moril, 1930)以及福建亚种[2](M.fortis fujianensis hong, 1981)....
摘要:血吸虫疫苗的研究已经开展多年,迄今还没有取得突破性的进展.大量的实验结果表明,致弱疫苗在多种动物模型中均能诱导出高保护力,提示获得高效且安全的疫苗是可行的.本文对血吸虫致弱疫苗的研究概况和最新进展进行了综述....
摘要:隐孢子虫病是世界最常见的6种腹泻病之一.其中,引起人类腹泻的主要是微小隐孢子虫.近十年来隐孢子虫病的暴发流行引起人们对这一原虫的关注,有关隐孢子虫病的免疫学以及分子生物学方面的研究也得到了蓬勃开展.该文对引起人类腹泻的微小隐孢子虫的抗原进行了综述....
[期刊论文] 曹建平 李小红 刘述先
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CSTPCD 北大核心
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摘要:疫苗是控制传染性疾病的有效手段,20世纪初人们曾设想研制血吸虫疫苗来预防和控制血吸虫病.血吸虫疫苗研究的历史,经历了从死疫苗、致弱活疫苗、亚单位疫苗到基因工程疫苗等的探索过程....
摘要:目的 鉴别安氏隐孢子虫卵囊的活力.方法 取适量新鲜纯化卵囊,高温灭活.首先用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法对灭活和未灭活卵囊进行染色,荧光显微镜下观察.同时提取灭活和未灭活两种卵囊的mRNA,反转录作为模板.基于隐孢子虫热激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因设计特异引物,用RT-PCR法对卵囊进行鉴别.结果 灭活卵囊经P1染色在荧光显微镜下呈亮红色,而新鲜纯化卵囊无此颜色.新鲜纯化卵囊经RT-PCR法可检测到HSP70的特异条带,而灭活卵囊则无此条带.结论 P1染色法与基于HSP70 mRNA降解的RT-PCR法均可对隐孢子虫卵囊的活力进行鉴别....
摘要:目的研究日本血吸虫大陆株三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性.方法将用免疫筛库得到的日本血吸虫大陆株GAPDH编码基因以PCR扩增,扩增产物T-A克隆至载体pT-Adv而后与真核表达载体pcDNA3连接,构建成核酸疫苗(pcDNA3-SjGAPDH).将纯化的pcDNA3-SjGAPDH经后腿胫前肌免疫C57BL/6小鼠.免疫荧光染色法研究pcDNA3-SjGAPDH在注射的局部肌肉表达特性;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blotting)、ELISA等方法分析pcDNA3-SjGAPDH所诱导的特异性免疫应答特征.结果pcDNA3-SjGAPDH免疫后24和48 h即可在荧光显微镜下看到C57BL/6小鼠小腿胫前肌的局部肌肉的冰冻切片发出淡绿色荧光,表明有GAPDH蛋白的表达.pcDNA3-SjGAPDH免疫小鼠主要诱生IgG2a、IgG2b和IgG3亚类;免疫小鼠脾淋巴细胞体外经特异性抗原刺激主要诱生γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)细胞因子,未检出IL-4.另外,免疫鼠血清能够识别日本血吸虫SWAP中的天然GAPDH成分.结论pcDNA3-SjGAPDH核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠主要诱导Th1类型细胞免疫应答....
摘要:目的 预测旋毛虫成虫期Ad48 h-Ts3基因和旋毛虫四跨膜基因的抗原性,合成和表达这两个基因并评价其潜在诊断价值. 方法 对旋毛虫四跨膜基因和成虫期Ad48h-Ts3基因采用生物信息学分析其亲、疏水性,预测其可能的抗原表位,对其密码子优化后进行基因序列合成,并亚克隆至pET28a表达载体,在大肠埃希菌中表达获得重组蛋白,以小鼠感染血清进行Western blotting识别重组蛋白,评估其诊断价值. 结果 生物信息学分析表明,旋毛虫四跨膜基因在其他物种中存在同源序列,具有两个跨膜区;而成虫期基因Ad48 h-Ts3具有丰富的抗原表位,为旋毛虫所特有;这两个基因经亚克隆至表达载体后,可观察到Ad48 h-Ts3基因有较明显的表达,且表达产物可被感染旋毛虫的小鼠血清识别,而四跨膜蛋白未见明显表达. 结论 旋毛虫成虫期蛋白Ad48 h-Ts3原核表达成功并可作为旋毛虫病诊断的潜在候选抗原....
摘要:树突状细胞是目前已知的功能最强的一类抗原呈递细胞,是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁,近年来研究进展显著.在血吸虫病领域的研究发现,宿主树突状细胞经血吸虫感染刺激后的表型与常规成熟的表型不同.研究血吸虫感染与宿主树突状细胞之间的相互作用将有助于丰富该类细胞的生物学研究,也将为血吸虫病的疫苗和治疗研究提供支撑....
摘要:目的研究日本血吸虫肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗对小鼠的保护效果.方法用致弱童虫免疫血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,获得的阳性克隆之一与曼氏血吸虫肌球蛋白重链基因同源.PCR法扩增该片断基因,产物克隆入真核表达载体pcDNA3中,构建成肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗.将50μg肌球蛋白(myosin)核酸疫苗注射C57BL/6小鼠的两侧股四头肌,免疫3次,间隔2周,末次免疫后2周经腹部皮肤攻击感染尾蚴30条/鼠,感染6周后用门静脉灌注法收集成虫,计算核酸疫苗免疫组减虫率与空质粒对照组减虫率.结果核酸疫苗免疫组获得了33.02%的减虫率,空质粒对照组获得了24.50%的减虫率,经t检验,两组差异无显著性.结论肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗在小鼠中未能诱导出保护力....
摘要:目的用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因.方法用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对阳性重组子进行克隆、测序,利用软件对核酸序列进行分析,确定目的基因.结果筛选出6种蛋白分子基因:3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin),线粒体编码蛋白,肌球蛋白(myosin)部分重链基因以及两个未知新基因.结论紫外线致弱疫苗免疫血清筛选cDNA文库为寻找新的抗血吸虫病疫苗提供了又一途径....
摘要:血吸虫病仍然是我国严重的公共卫生问题之一.诊断抗原一直是血吸虫病诊断研究的热点.随着分子生物学技术的发展,血吸虫病的诊断抗原已由最初采用的粗抗原发展为组分抗原以及由基因重组的方法生产合成的重组抗原.该文综述了近年来血吸虫分子诊断抗原的研究进展....
摘要:目的观察日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白重组抗原在小鼠诱导抗血吸虫感染的免疫保护作用.方法30只雌性G57BL/6小鼠随机分为3组,reSjcTrx免疫组:reSjcTrx(15mg/鼠)和ISA720佐剂乳化后采用小鼠相背部多点皮下注射,共免疫3次,间隔2周;ISA720佐剂对照组:小鼠仅注射ISA720佐剂和生理盐水;感染对照组不作任何处理.于末次免疫后3周,各组小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴,感染后6周剖杀,门静脉灌注法收集成虫,计成虫数和每克肝组织虫卵数.在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清,用ELISA检测重组抗原特异性IgG抗体.并对reSicTrx进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析.结果ELISA检测表明,reSjcTrx免疫组小鼠产生特异性IgG抗体应答,并诱导小鼠产生对攻击感染的减虫率和肝组织减卵率分别为22.8%和29.5%,与ISA720佐剂对照组和感染对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).SDS-PAGE和Western blotting的结果表明,该重组抗原相对分子质量(Mr)约14 000(含载体的6个氨基酸),可被日本血吸虫感染兔血清和reSjcTrx免疫小鼠血清所识别.结论reSjcTrx免疫小鼠可产生一定的抗血吸虫感染的保护作用....
摘要:目的 用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测旋毛虫DNA. 方法 用酚-氯仿法提取旋毛虫基因组DNA,设计两对扩增旋毛虫18S rRNA基因的LAMP引物,以日本血吸虫DNA作对照,进行LAMP反应.将旋毛虫基因组DNA经梯度稀释,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性.产物经SYBR Green I显色后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性. 结果 LAMP反应结果显示,旋毛虫基因检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色.LAMP技术可检测到的旋毛虫最低浓度为415fg/μl. 结论 建立了检测旋毛虫DNA的LAMP技术....
摘要:目的 克隆和表达日本血吸虫嗜肌素样蛋白(SjcMLP)编码基因,并研究其重组抗原的免疫原性.方法 PCR扩增SjcMLP编码基因,并亚克隆入表达载体pQE30.将重组表达质粒pQE30-SjcMLP转入宿主菌E.coli M15,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用金属Ni螯合物亲和层析柱(Ni-NTA)纯化SjcMLP重组蛋白(reSjcMLP).纯化的reSjcMLP采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blot)作进一步分析.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定用reSjcMLP免疫C57BL/6小鼠血清中的抗体水平.结果 SDS-PAGE分析表明获得的重组抗原的大小约24.8 kDa,与预计的融合蛋白大小相符.Western blot显示该重组抗原能被日本血吸虫尾蚴感染兔血清识别.用该重组抗原包被进行ELISA检测,免疫血清滴度高达1:12800.但动物免疫试验结果减虫效果不明显.结论 SjcMLP编码基因以可溶性融合蛋白的形式得到表达,动物免疫试验未诱导出明显的保护力....
摘要:目的 观察旋毛虫幼虫侵入前后小鼠肠上皮细胞蛋白的变化,筛选幼虫侵入相关蛋白.方法 将旋毛虫感染性幼虫接种至小鼠小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)单层,于37℃5% CO2条件下培养2h,提取细胞蛋白,进行SDS-PAGE与Western blot分析,并与正常IECs细胞蛋白比较.结果 SDS-PAGE分析表明,IECs与感染性幼虫共孵育后的IECs蛋白带数为44条,与正常IECs对照组的相同;Western blot显示,正常IECs蛋白不能被旋毛虫感染鼠血清识别,与幼虫共孵育后的IECs蛋白有16个组分带能被旋毛虫感染鼠血清识别,分子质量单位分别为125、118、106、98、70、64、50、47、46、40、34、33、31、29、27、26 ku.结论 小鼠IECs与旋毛虫幼虫共培养可产生能被旋毛虫感染鼠血清识别的细胞蛋白,该组蛋白可能是旋毛虫侵入相关蛋白....
摘要:目的 克隆、表达日本血吸虫(大陆株)3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjcGAPDH)编码基因并作结构预测.方法 将编码SjcGAPDH的pBluescript质粒用限制性内切酶Xho Ⅰ和Sac Ⅰ消化后,收集目的片段,与经同样酶切的原核表达载体pET28b连接,筛选重组克隆并测序,将正确的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细菌,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白.用GeneRunner 软件对该蛋白的结构及抗原表位进行预测.结果 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到大小约42.7 kDa的特异性蛋白条带,与预计一致.免疫印迹试验(Western blot)结果表明致弱尾蚴免疫兔血清可识别该重组蛋白.结构预测表明SjcGAPDH的第50~70、102~122、135~148、165~175、187~205、254~272、278~285位氨基酸区域可能为蛋白质的抗原优势区域.结论 SjcGAPDH编码基因克隆、表达获得成功,为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础,对GAPDH的结构和性质预测为探索该蛋白的抗原优势表位提供了理论依据....
摘要:目的 克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr 70000热休克蛋白(CaHSP70)的部分编码基因.方法 依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因.PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-CaHSP70,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白(简称为rCaHSP70).用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定.采用相关生物信息学软件对序列进行分析.结果 根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致.SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组蛋白(rCaHSP70)Mr约为43 000(含6个组氨酸),以包涵体的形式存在,可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别.rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇.种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近.ELISA检测结果表明,rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前.结论 XZ-BOV HSP70部分编码基因的克隆获得成功,研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性....
摘要:目的观察日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx)在小鼠诱导抗血吸虫感染的免疫保护作用.方法制备pcDNA3-SjcTrx重组质粒,将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,每组10只:pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫组、pcDNA3空质粒对照组和攻击感染对照组.核酸疫苗免疫组每只小鼠经股四头肌注射100μg核酸疫苗,共注射3次,间隔2周.空质粒对照组每只小鼠在相应时间经股四头肌注射100μgpcDNA3空质粒,感染对照组则不注射任何质粒.于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴.小鼠于攻击感染后42天剖杀,门脉灌注收集成虫,计数成虫数和肝内虫卵数.分别在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体.另取6只雌性C57BL/6小鼠经股四头肌注射核酸疫苗,分别于注射后24、48小时和72小时取肌肉注射部位局部组织制备冰冻切片,用免疫酶染色试验(IEST)检测注射局部组织抗原的表达情况,以注射pcDNA3空质粒者为对照.结果IEST结果表明该DNA疫苗在小鼠肌肉组织内表达,ELISA检测表明DNA疫苗免疫小鼠后产生明显的抗体(IgG)免疫应答,并诱导出对攻击感染的45.7%的减虫率和41.4%的肝组织减卵率(P<0.05).结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗具有较好的免疫原性,在小鼠诱导出明显的免疫保护作用,可作为疫苗候选分子作进一步的研究....
摘要:目的 研究比较小鼠树突状细胞DC2.4和骨髓来源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cell,BMDC)经血吸虫抗原谷胱甘肽转移酶(GST)刺激后表面分子的表达异同.方法 骨髓来源的细胞经白介素4(interleukin 4,IL-4)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystimulating factor,GM-CSF)诱导培养,获得树突状细胞.常规方法培养DC2.4.体外用日本血吸虫抗原GST刺激前述两种细胞,以PBS和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作对照,流式细胞仪检测细胞表面分子CD40、CDSO、CD86的平均荧光强度,并进行统计学分析.结果 日本血吸虫抗原GST刺激BMDC后,表面分子CD40、CD80、CD86的平均荧光强度依次为100.39、42.38、170.83,与PBS对照组比较,CD40无明显变化,而CD80、CD86表达上调(P<0.01);GST刺激DC2.4后,细胞表面分子CD40、CD80、CD86的平均荧光强度依次为23.73、72.13、59.58,与PBS对照组比较,CD40和CD86表达上调(P<0.01),而CD80变化不明显.结论 DC2.4与BMDC经日本血吸虫抗原刺激后表面分子的表达变化不同....
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