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摘要:目的 预测旋毛虫成虫期Ad48 h-Ts3基因和旋毛虫四跨膜基因的抗原性,合成和表达这两个基因并评价其潜在诊断价值. 方法 对旋毛虫四跨膜基因和成虫期Ad48h-Ts3基因采用生物信息学分析其亲、疏水性,预测其可能的抗原表位,对其密码子优化后进行基因序列合成,并亚克隆至pET28a表达载体,在大肠埃希菌中表达获得重组蛋白,以小鼠感染血清进行Western blotting识别重组蛋白,评估其诊断价值. 结果 生物信息学分析表明,旋毛虫四跨膜基因在其他物种中存在同源序列,具有两个跨膜区;而成虫期基因Ad48 h-Ts3具有丰富的抗原表位,为旋毛虫所特有;这两个基因经亚克隆至表达载体后,可观察到Ad48 h-Ts3基因有较明显的表达,且表达产物可被感染旋毛虫的小鼠血清识别,而四跨膜蛋白未见明显表达. 结论 旋毛虫成虫期蛋白Ad48 h-Ts3原核表达成功并可作为旋毛虫病诊断的潜在候选抗原....
摘要:目的 用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测旋毛虫DNA. 方法 用酚-氯仿法提取旋毛虫基因组DNA,设计两对扩增旋毛虫18S rRNA基因的LAMP引物,以日本血吸虫DNA作对照,进行LAMP反应.将旋毛虫基因组DNA经梯度稀释,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性.产物经SYBR Green I显色后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性. 结果 LAMP反应结果显示,旋毛虫基因检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色.LAMP技术可检测到的旋毛虫最低浓度为415fg/μl. 结论 建立了检测旋毛虫DNA的LAMP技术....
摘要:目的 鉴别安氏隐孢子虫卵囊的活力.方法 取适量新鲜纯化卵囊,高温灭活.首先用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法对灭活和未灭活卵囊进行染色,荧光显微镜下观察.同时提取灭活和未灭活两种卵囊的mRNA,反转录作为模板.基于隐孢子虫热激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因设计特异引物,用RT-PCR法对卵囊进行鉴别.结果 灭活卵囊经P1染色在荧光显微镜下呈亮红色,而新鲜纯化卵囊无此颜色.新鲜纯化卵囊经RT-PCR法可检测到HSP70的特异条带,而灭活卵囊则无此条带.结论 P1染色法与基于HSP70 mRNA降解的RT-PCR法均可对隐孢子虫卵囊的活力进行鉴别....
摘要:目的 研究比较小鼠树突状细胞DC2.4和骨髓来源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cell,BMDC)经血吸虫抗原谷胱甘肽转移酶(GST)刺激后表面分子的表达异同.方法 骨髓来源的细胞经白介素4(interleukin 4,IL-4)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystimulating factor,GM-CSF)诱导培养,获得树突状细胞.常规方法培养DC2.4.体外用日本血吸虫抗原GST刺激前述两种细胞,以PBS和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作对照,流式细胞仪检测细胞表面分子CD40、CDSO、CD86的平均荧光强度,并进行统计学分析.结果 日本血吸虫抗原GST刺激BMDC后,表面分子CD40、CD80、CD86的平均荧光强度依次为100.39、42.38、170.83,与PBS对照组比较,CD40无明显变化,而CD80、CD86表达上调(P<0.01);GST刺激DC2.4后,细胞表面分子CD40、CD80、CD86的平均荧光强度依次为23.73、72.13、59.58,与PBS对照组比较,CD40和CD86表达上调(P<0.01),而CD80变化不明显.结论 DC2.4与BMDC经日本血吸虫抗原刺激后表面分子的表达变化不同....
摘要:目的 研究负载GST抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫小鼠抗日本血吸虫感染的作用.方法 将GST抗原纯化后负载树突状细胞株DC2.4,免疫荧光染色法检测GST的负载情况,并进行动物保护性实验.35只C57BL/6小鼠随机均分7组(每组5只),分别作免疫注射:A组为未处理的DC,B组为牛血清白蛋白(BSA)处理的DC,C组为GST负载的DC,D组为GST+CpG ODN共刺激的DC,E组为CpG ODN刺激的DC,F组为GST蛋白,G组为空白对照组.A~E各组DC经0.25%胰蛋白酶消化后用PBS调整密度至107/ml,每鼠皮下注射0.1 ml,每次间隔2周,共免疫3次.F组首次每鼠免疫50 μg GST蛋白加福氏完全佐剂,第2、3次分别免疫50 μg、10 μg GST蛋白加福氏不完全佐剂,均为皮下注射.各组于末次免疫后10 d收集血清,ELISA方法分析血清中的特异性抗体.各组小鼠于末次免疫后2周每鼠经腹部感染尾蚴30±1条.6周后剖杀小鼠,计算减虫率.结果 DC经GST负载后可在荧光显微镜下观察到抗GST的特异荧光,表明抗原已被DC摄取.各组小鼠免疫后,F组抗体水平最高,为2.127 0±0.411 5,另外C组(0.555 2±0.078 9)和D组(0.715 0±0.052 3)的抗体水平均高于G组(0.235 8± 0.088 9), 差异有统计学意义(P<0.05).免疫后攻击感染,D组小鼠的减虫率最高为53.3%,其次为F组(24.0%)和C组(21.3%),但D组与两组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 CpG ODN联合GST抗原负载的树突状细胞疫苗具有一定的抗日本血吸虫感染作用....
摘要:目的:观察日本血吸虫(大陆株)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase, HGPRT)重组抗原(reSjc HGPRT)与ISA206或弗氏佐剂联合免疫对小鼠诱导抗日本血吸虫感染的保护作用. 方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为5组:reSjc HGPRT加ISA206佐剂免疫组、reSjc HGPRT加弗氏佐剂组、ISA206佐剂对照组、弗氏佐剂对照组和感染对照组.20 μg重组抗原和ISA206或弗氏佐剂乳化后小鼠项背部多点皮下注射,共免疫3次,每次间隔2周.佐剂对照组小鼠仅注射ISA206或弗氏佐剂和生理盐水,感染对照组不注射任何重组抗原或生理盐水.于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴,6周后剖杀小鼠,门脉灌注收集成虫,计数成虫数、雌雄合抱数和小鼠肝组织虫卵数.在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体. 结果:重组抗原加ISA206佐剂或弗氏佐剂免疫组均诱导小鼠产生特异性IgG抗体应答,与感染对照组和弗氏佐剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);诱导小鼠产生的减虫率、减雌雄合抱率和肝组织减卵率分别为53.7%、59.3%、44.9%和43.3%、44.1%、33.0%,与感染对照组和2种佐剂对照组相比均有统计学意义(P<0.05).结论:reSjc HGPRT与ISA206或弗氏佐剂联合免疫,可诱导小鼠产生抗血吸虫感染保护作用....
摘要:树突状细胞是目前已知的功能最强的一类抗原呈递细胞,是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁,近年来研究进展显著.在血吸虫病领域的研究发现,宿主树突状细胞经血吸虫感染刺激后的表型与常规成熟的表型不同.研究血吸虫感染与宿主树突状细胞之间的相互作用将有助于丰富该类细胞的生物学研究,也将为血吸虫病的疫苗和治疗研究提供支撑....
摘要:目的 获得日本血吸虫病新的候选疫苗分子.方法 用对日本血吸虫具有天然抗性的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库,阳性克隆转入E. coli BM25.8环化成质粒,抽提质粒DNA,EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定,插入片段进行核苷酸序列测序,并进行生物信息学分析. 结果共获得12个不同的基因,插入片段长度为300~1 100 bp,其中2个具有完整的开放阅读框,为日本血吸虫新基因,命名为Sj-sMf1和Sj-sMf2,分别编码93个和61个氨基酸.前者含有cAMP磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点各1个,后者含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶C磷酸化位点. 结论用东方田鼠血清作为探针筛选到2个日本血吸虫新基因....
摘要:目的 克隆和表达日本血吸虫嗜肌素样蛋白(SjcMLP)编码基因,并研究其重组抗原的免疫原性.方法 PCR扩增SjcMLP编码基因,并亚克隆入表达载体pQE30.将重组表达质粒pQE30-SjcMLP转入宿主菌E.coli M15,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用金属Ni螯合物亲和层析柱(Ni-NTA)纯化SjcMLP重组蛋白(reSjcMLP).纯化的reSjcMLP采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blot)作进一步分析.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定用reSjcMLP免疫C57BL/6小鼠血清中的抗体水平.结果 SDS-PAGE分析表明获得的重组抗原的大小约24.8 kDa,与预计的融合蛋白大小相符.Western blot显示该重组抗原能被日本血吸虫尾蚴感染兔血清识别.用该重组抗原包被进行ELISA检测,免疫血清滴度高达1:12800.但动物免疫试验结果减虫效果不明显.结论 SjcMLP编码基因以可溶性融合蛋白的形式得到表达,动物免疫试验未诱导出明显的保护力....
摘要:目的 克隆、表达日本血吸虫(大陆株)3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjcGAPDH)编码基因并作结构预测.方法 将编码SjcGAPDH的pBluescript质粒用限制性内切酶Xho Ⅰ和Sac Ⅰ消化后,收集目的片段,与经同样酶切的原核表达载体pET28b连接,筛选重组克隆并测序,将正确的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细菌,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白.用GeneRunner 软件对该蛋白的结构及抗原表位进行预测.结果 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到大小约42.7 kDa的特异性蛋白条带,与预计一致.免疫印迹试验(Western blot)结果表明致弱尾蚴免疫兔血清可识别该重组蛋白.结构预测表明SjcGAPDH的第50~70、102~122、135~148、165~175、187~205、254~272、278~285位氨基酸区域可能为蛋白质的抗原优势区域.结论 SjcGAPDH编码基因克隆、表达获得成功,为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础,对GAPDH的结构和性质预测为探索该蛋白的抗原优势表位提供了理论依据....
摘要:目的 克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr 70000热休克蛋白(CaHSP70)的部分编码基因.方法 依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因.PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-CaHSP70,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白(简称为rCaHSP70).用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定.采用相关生物信息学软件对序列进行分析.结果 根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致.SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组蛋白(rCaHSP70)Mr约为43 000(含6个组氨酸),以包涵体的形式存在,可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别.rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇.种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近.ELISA检测结果表明,rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前.结论 XZ-BOV HSP70部分编码基因的克隆获得成功,研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性....
摘要:目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因.方法 依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物,上游和下游引物分别引入BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点.以日本血吸虫大陆株(安徽株,简称Sjc-A)成虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因.经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT,转化感受态E.coli BL21,并大量扩增.重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定.pET28a-SjcHGPRT/E.coli BL21工程菌用IPTG诱导表达,重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析.结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp,构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段,根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株(湖南株,简称Sjc-H)及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性.获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析,分子量约30 kDa,并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别.结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功,并获得了纯化重组蛋白,为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础....
摘要:目的 分离和鉴定采自徐州自然感染奶牛粪便中的隐孢子虫卵囊.方法 在徐州某奶牛场采集经改良抗酸染色镜检确认为隐孢子虫感染的奶牛粪便,用不连续Sheather's蔗糖密度梯度离心法纯化卵囊.采用Chelex-100方法提取卵囊基因组DNA,设计引物扩增小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因和卵囊囊壁蛋白(COWP)基因,分别克隆到pGEM-T和pGEM-T Easy载体,测定核苷酸序列,运用BLAST和MEGA软件进行序列同源性和种系发生分析.结果 分离的隐孢子虫卵囊个体大小为(7.4±0.32)μm×(5.4±0.21)μm,长宽比为1.37±0.07(n=20).徐州牛源隐孢子虫与GenBank公布的安氏隐孢子虫比较,SSU rRNA和COWP基因序列同源性分别为100%和99%.种系发生分析显示该株隐孢子虫与安氏隐孢子虫处于同一分支.结论 由徐州自然感染奶牛粪便中分离获得的隐孢子虫是安氏隐孢子虫....
摘要:血吸虫病仍然是我国严重的公共卫生问题之一.诊断抗原一直是血吸虫病诊断研究的热点.随着分子生物学技术的发展,血吸虫病的诊断抗原已由最初采用的粗抗原发展为组分抗原以及由基因重组的方法生产合成的重组抗原.该文综述了近年来血吸虫分子诊断抗原的研究进展....
摘要:目的观察日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白重组抗原在小鼠诱导抗血吸虫感染的免疫保护作用.方法30只雌性G57BL/6小鼠随机分为3组,reSjcTrx免疫组:reSjcTrx(15mg/鼠)和ISA720佐剂乳化后采用小鼠相背部多点皮下注射,共免疫3次,间隔2周;ISA720佐剂对照组:小鼠仅注射ISA720佐剂和生理盐水;感染对照组不作任何处理.于末次免疫后3周,各组小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴,感染后6周剖杀,门静脉灌注法收集成虫,计成虫数和每克肝组织虫卵数.在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清,用ELISA检测重组抗原特异性IgG抗体.并对reSicTrx进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析.结果ELISA检测表明,reSjcTrx免疫组小鼠产生特异性IgG抗体应答,并诱导小鼠产生对攻击感染的减虫率和肝组织减卵率分别为22.8%和29.5%,与ISA720佐剂对照组和感染对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).SDS-PAGE和Western blotting的结果表明,该重组抗原相对分子质量(Mr)约14 000(含载体的6个氨基酸),可被日本血吸虫感染兔血清和reSjcTrx免疫小鼠血清所识别.结论reSjcTrx免疫小鼠可产生一定的抗血吸虫感染的保护作用....
[期刊论文] 曹建平 李小红 刘述先
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:疫苗是控制传染性疾病的有效手段,20世纪初人们曾设想研制血吸虫疫苗来预防和控制血吸虫病.血吸虫疫苗研究的历史,经历了从死疫苗、致弱活疫苗、亚单位疫苗到基因工程疫苗等的探索过程....
摘要:目的研究日本血吸虫大陆株三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性.方法将用免疫筛库得到的日本血吸虫大陆株GAPDH编码基因以PCR扩增,扩增产物T-A克隆至载体pT-Adv而后与真核表达载体pcDNA3连接,构建成核酸疫苗(pcDNA3-SjGAPDH).将纯化的pcDNA3-SjGAPDH经后腿胫前肌免疫C57BL/6小鼠.免疫荧光染色法研究pcDNA3-SjGAPDH在注射的局部肌肉表达特性;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blotting)、ELISA等方法分析pcDNA3-SjGAPDH所诱导的特异性免疫应答特征.结果pcDNA3-SjGAPDH免疫后24和48 h即可在荧光显微镜下看到C57BL/6小鼠小腿胫前肌的局部肌肉的冰冻切片发出淡绿色荧光,表明有GAPDH蛋白的表达.pcDNA3-SjGAPDH免疫小鼠主要诱生IgG2a、IgG2b和IgG3亚类;免疫小鼠脾淋巴细胞体外经特异性抗原刺激主要诱生γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)细胞因子,未检出IL-4.另外,免疫鼠血清能够识别日本血吸虫SWAP中的天然GAPDH成分.结论pcDNA3-SjGAPDH核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠主要诱导Th1类型细胞免疫应答....
摘要:东方田鼠(Microtus fortis)[1]亦称米氏田鼠(Microtus michnoi kastschenko, 1910)或沼泽田鼠、远东田鼠、大田鼠、长江田鼠及湖鼠.属于啮齿目,仓鼠科,田鼠亚科,田鼠属,在我国分布甚广.我国的东方田鼠大致可分为5个亚种:分布于陕西、甘肃的指名亚种(M.fortis fortis Büchner,1889)、分布于长江中下游的长江亚种(M.fortis calamorum Thomas,1902)、分布于东北等地的黑龙江亚种(M.fortis pelliceus Thomas, 1911)和辽宁亚种(M.fortis fortis dolichoephalus Moril, 1930)以及福建亚种[2](M.fortis fujianensis hong, 1981)....
摘要:目的观察日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx)在小鼠诱导抗血吸虫感染的免疫保护作用.方法制备pcDNA3-SjcTrx重组质粒,将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,每组10只:pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫组、pcDNA3空质粒对照组和攻击感染对照组.核酸疫苗免疫组每只小鼠经股四头肌注射100μg核酸疫苗,共注射3次,间隔2周.空质粒对照组每只小鼠在相应时间经股四头肌注射100μgpcDNA3空质粒,感染对照组则不注射任何质粒.于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴.小鼠于攻击感染后42天剖杀,门脉灌注收集成虫,计数成虫数和肝内虫卵数.分别在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体.另取6只雌性C57BL/6小鼠经股四头肌注射核酸疫苗,分别于注射后24、48小时和72小时取肌肉注射部位局部组织制备冰冻切片,用免疫酶染色试验(IEST)检测注射局部组织抗原的表达情况,以注射pcDNA3空质粒者为对照.结果IEST结果表明该DNA疫苗在小鼠肌肉组织内表达,ELISA检测表明DNA疫苗免疫小鼠后产生明显的抗体(IgG)免疫应答,并诱导出对攻击感染的45.7%的减虫率和41.4%的肝组织减卵率(P<0.05).结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗具有较好的免疫原性,在小鼠诱导出明显的免疫保护作用,可作为疫苗候选分子作进一步的研究....
摘要:目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较.方法微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析.Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性.结果 3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊.结论 3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测....
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