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摘要:目的 克隆并表达淋病奈瑟菌孔蛋白PorB,以重组蛋白为抗原,间接ELISA检测免疫血清的抗体水平.方法 利用PCR从淋病奈瑟菌WHO株基因组中扩增出PorB的基因,克隆入原核表达载体pET-30a中,构建出重组表达质粒pE'T30a-PorB,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.表达的蛋白进行SDS-PAGE分析,Western blot检测其反应原性.以纯化的重组蛋白rPorB作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测淋病疫苗pVAX1-PorB免疫小鼠后的血清抗体水平.结果 PCR扩增得到淋病奈瑟菌孔蛋白PorB基因,表达的重组蛋白rPorB相对分子质量约40 kD,经Ni-NTA亲和层析纯化后的rPorB在SDS-PAGE中显示单一条带,Western blot证明纯化后的rPorB可与淋病奈瑟菌免疫血清特异性结合,具有良好的免疫反应性.间接ELISA结果表明,淋病疫苗pVAX1-PorB免疫小鼠血清PorB特异性抗体滴度为1∶200.结论 成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PorB,PorB在大肠杆菌中获得表达.以纯化的rPorB为检测抗原,间接ELISA可以用于淋病疫苗免疫效果的评价.该研究为淋病奈瑟菌感染诊断、疫苗的研究奠定了基础....
摘要:目的:克隆、表达并纯化大肠杆菌M15碱性磷酸酶(EAP)成熟肽(phoA),分析其活性.方法:采用PCR技术从M15基因组DNA中扩增出phoA编码基因;构建其原核表达载体pCold-TF-EAP;转入E.coli BL21(DE3)进行表达;IMAC Ni-NTA柱层析法纯化重组蛋白;重组蛋白与底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性.结果:克隆得到了序列约1 400bp phoA编码基因,原核表达了分子量约为100 kDa的融合重组EAP(rEAP),纯化获得的rEAP具有催化磷酸单酯的活性,有效反应温度范围大,在27℃~67℃都具有较高的催化活性,在pH7.5 ~8.0间催化活性最高.结论:克隆了可正确表达EAP的phoA编码基因,为EAP的工业化生产及应用提供了生物材料....
摘要:目的 观察淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因真核表达质粒不同免疫途径诱导的小鼠特异性体液免疫应答效果.方法 将NspA基因真核表达质粒pcNspA通过肌肉、滴鼻和阴道3种途径免疫BALB/c小鼠,分别于0、2、3、4周各免疫1次,末次免疫后2周,收集各组小鼠血清、支气管肺泡洗液和阴道洗液,采用间接ELISA方法检测特异性抗体效价;并检测抗体介导的补体溶菌活性.结果 滴鼻免疫和肌肉免疫pcNspA质粒均可诱导小鼠体内产生较高水平的特异性IgG和IgA抗体,而且滴鼻免疫组在支气管肺泡洗液和阴道洗液中均可检测到特异性sIgA抗体,而阴道免疫组仅在阴道局部检测到较低水平的特异性sIgA抗体;滴鼻免疫组小鼠血清具有溶菌活性.结论 淋病奈瑟菌NspA基因真核表达质粒可诱导小鼠体内产生特异性抗体,并具有抗菌活性;滴鼻免疫可能是其更有效的免疫途径....
摘要:为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%.用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI.重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子....
摘要:目的 分析人初乳中溶菌酶(Lysozyme,LYZ)的理化特性及其抗菌活性.方法 取产后3 d内的产妇乳汁,根据人LYZ标准曲线,求得其中的LYZ活性.将人初乳分别置于60、72、85和100℃水浴中孵育0、1、3、5、10、15、20和30 min后取样,检测其中LYZ的活性,分析其热稳定性;将经稀释的人初乳分别调pH值至2.0、4.0、5.0、7.4、9.0和10.0,37℃孵育30 min,检测其中LYZ的活性,分析其对pH值的敏感性;将不同的金属离子加入人初乳中,使其终浓度为10 mmol/L,测定不同金属离子对人初乳中LYZ活性的影响;采用平板扩散法检测人初乳中LYZ的抑菌谱,并挑选敏感菌株进行定量抑菌试验.结果 人初乳中LYZ的活性为(9 650±236)U/ml,在60℃~85℃和pH 2.0~10.0的条件下均可保持较强的活性,对多种金属离子具有一定的耐受性.人初乳中LYZ对多种革兰阳性及阴性细菌具有不同程度的抑菌作用,但对白色念珠菌无抑制作用.结论 人初乳中的LYZ稳定性强,抗菌谱广,具有广泛的应用价值....
摘要:目的 做好病原生物学精品课程的建设工作.方法 从师资队伍、教学管理、教学内容、教学方法、课程文化等方面进行了探讨和实践.结果 精品课程的建没工作取得了显著的成效.结论 课程建设是衡量学校办学水平和教学质量的重要标志,是实现人才培养同标的基本保证....
摘要:课程建设是衡量学校办学水平和教学质量的重要标志,是实现培养目标的基本保证.作者从师资队伍、教学管理、教学内容、教学方法和课程文化等方面对病原生物学精品课程的建设进行了探讨和实践....
摘要:为研究人CD46(hCD46)在菌毛介导的淋病奈瑟菌宿主特异性黏附过程中的作用.用连接PCR技术扩增出启动子与cDNA相连的hCD46小基因,并将其置换出pcDNA3.1载体中的CMV启动子,构建成重组真核表达载体pCD46.转染COS-1细胞后用间接免疫荧光法检测到hCD46 cDNA在其自身启动子的指导下可在COS-1细胞膜表面有效表达,Western blotting检测表明表达产物的分子量正确,用流式细胞术分选表达hCD46的基因转染细胞COS-1-46.细菌黏附实验显示菌毛阳性淋病奈瑟菌临床分离株对COS-1-46细胞有较强的黏附性.提示hCD46是菌毛介导的淋病奈瑟菌特异性黏附于人黏膜细胞的一种重要受体,hCD46小基因可用于淋病奈瑟菌感染转基因小鼠模型的制备....
摘要:目的 构建含有小鼠CD40L基因的重组真核表达载体,并鉴定其在转染细胞中的表达.方法 自活化的T细胞经RT-PCR得到小鼠CD40L的cDNA基因,将其克隆入真核表达载体pCMV-Myc,获得重组质粒pCMV-Myc/CD40L,酶切及测序鉴定;脂质体法转染CHO细胞,使用RT-PCR及流式细胞技术分别从mRNA和蛋白水平对CD40L的表达进行检测.结果 将pCMV-Myc/CD40L真核表达载体转染CHO细胞,RT-PCR和流式细胞仪检测证实小鼠CD40L在真核细胞中暂态表达.结论 成功地建立表达小鼠CD40L基因的重组真核表达载体,为进一步研究其生物学特性及肿瘤的基因治疗提供了基础....
摘要:为了构建人CD46(hCD46)启动子指导目的基因表达的真核表达载体,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR扩增出hCD46基因的启动子区域,序列分析结果表明其与GenBank中hCD46基因5'端某片段的同源性为99.9%.用此启动子替换pcDNA3EGFP中的CMV启动子,并在hCD46启动子和EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因第二内含子(RGI),得到的重组表达载体转染CHO和SP2/0两种鼠源细胞,流式细胞术检测表明CHO细胞EGFP的表达量高于SP2/0细胞,表达特性与人体CD46相似;RGI可以增强EGFP的表达量,但不改变其表达的组织特异性,提示克隆的hCD46启动子可以用于研制模拟人体CD46基因表达特性的转基因小鼠....
摘要:人溶菌酶(hLYZ)又称胞壁质酶,能水解细菌细胞壁中粘多糖的β1~4糖苷键,对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用,在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下,对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用.用于临床治疗, hLYZ具有消炎、消肿、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用.hLYZ还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,并能与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复盐而使病毒失活[1]....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:为了对鸡输卵管特异表达载体表达的重组人溶菌酶(rhLYZ)的理化及生物学特性进行鉴定,用直接结晶法从重组载体注射鸡蛋清中提取溶菌酶,以兔抗hLYZ血清为一抗,HRP-标记的羊抗免IgG为二抗,进行Western blotting检测,结果表明表达在鸡蛋清中的rhLYZ能被hLYZ特异抗体识别;将纯化的rhLYZ和天然hLYZ在不同温度的水浴中孵育30min,用RBB-R染料标记比色法检测溶菌酶活性的变化,结果显示二者的热稳定性无显著差异;将纯化的rhLYZ和天然hLYZ用不同PH的溶液稀释,40C孵育30min后进行酶的活性测定,结果显示两者在pH3.0~11.0范围内具有活性,最强活性pH为7.0;以12种常见细菌为试验对象,用最小抑菌浓度法测定含rhLYZ蛋清和纯化rhLYZ的溶菌活性,结果显示两者对鲫鱼嗜水气单胞菌、变形杆菌、枯草杆菌、无鞭毛伤寒杆菌、白色念珠菌和柠檬色葡萄球菌具有很强的抑制作用,对痢疾杆菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较强的抑制作用,对有鞭毛伤寒杆菌和鳖嗜水气单胞菌无明显的抑制作用.这些试验结果显示,表达在重组载体注射鸡蛋清中的rhLYZ具有与天然hLYZ十分相似的相对分子质量、热稳定性、pH活性范围和溶菌谱....
摘要:目的 探讨用雌激素构建淋病奈瑟菌感染小鼠模型的方法.方法 淋病奈瑟菌WHO-A接种经皮下注射苯甲酸雌二醇和真皮下埋植尼尔雌醇片(雌三醇)预处理的雌性ICR小鼠,小鼠阴道拭子接种T-M选择培养基培养分离淋病奈瑟菌,取小鼠阴道分泌物涂片染色观察淋病奈瑟菌感染情况,比较两种雌激素对小鼠淋病奈瑟菌感染的差异.结果 与对照组相比,苯甲酸雌二醇小鼠体内淋病奈瑟菌有短时间的定植,而尼尔雌醇组与对照组无差异.结论 雌激素(尤其是雌二醇)有利于淋病奈瑟菌在小鼠阴道内的定植....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA
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摘要:用直接结晶法从重组载体注射鸡蛋清中提取重组人溶菌酶(rhLYZ),并对其理化及生物学特性进行了鉴定.结果显示,rhLYZ能被hLYZ特异抗体识别;纯化的rhLYZ和天然hLYZ的热稳定性无显著差异,二者在pH 3.0~11.0范围内均具有活性, pH为7.0时活性最强.采用最小抑菌浓度法测定了含rhLYZ蛋清和纯化rhLYZ对12种常见细菌的溶菌活性,二者对除有鞭毛伤寒杆菌和鳖嗜水气单胞菌以外的参试菌均有不同程度的抑制作用.表明,表达在重组载体注射鸡蛋清中的rhLYZ具有与天然hLYZ十分相似的分子质量、热稳定性、pH活性范围和溶菌谱....
摘要:目的:摸索精确检测本室制备的人溶菌酶(hLYZ)转基因小鼠乳汁中重组酶表达量的方法.方法:对溶菌酶检测的两种常规方法-琼脂平板扩散法和光学比浊法进行了改进,并以hLYZ标准品为检测对象,比较了改进后两种方法的优缺点.采用改进后的琼脂平板扩散法对转基因小鼠乳汁中表达的重组hLYZ进行检测.结果:在敏感性和可重复性方面,此两种方法无明显差别,但琼脂平板扩散法无特殊要求且简便易行.结论:改进的琼脂平板扩散法是一种更适宜于检测大批量微量样品中LYZ活性的良好方法....
摘要:淋病导致的公共卫生问题在世界范围内广泛存在.淋病奈瑟菌的唯一宿主是人类,该菌侵袭泌尿生殖道引起淋病.其感染的关键是黏附因子对黏膜细胞的黏附.淋病奈瑟菌主要黏附因子与细胞受体间的作用机制已经在细胞水平上研究得比较清楚,表达淋病奈瑟菌黏附因子受体的转基因动物可望成为淋病研究的合适动物模型,为深入研究淋病奈瑟菌的致病机制、研制淋病疫苗及新型治疗药物提供有效工具....
摘要:目的研究自行克隆的1.5kbhLYZ双链cDNA的表达特性.方法将此cDNA亚克隆人真核表达载体pcDNA3及乳腺特异表达载体p205C3,重组载体pcDNA3LYZ转染COS-1细胞,用间接免疫荧光法检测转染细胞中hLYZ cDNA的表达;重组载体p205C3LYZ注射哺乳期小鼠,用微球菌溶解试验和斑点杂交试验检测hLYZ cDNA在小鼠体内的表达.结果hLYZ cDNA在转染的COS-1细胞中得到了正确表达;小鼠体内表达并分泌到乳汁中的hLYZ达87μg/ml,且目的基因的表达具有较好的组织特异性.结论hLYZ cDNA可在COS-1细胞中有效表达,基因构件p205C3LYZ可以用于动物乳腺生物反应器研制....
摘要:奈瑟氏淋球菌容易感染人,却难以感染所有常用实验动物,因此长期以来一直缺少合适的实验动物模型,严重限制奈瑟氏淋球菌的研究进展.雌激素有一定的抗炎作用,利用雌激素处理的小鼠建立奈瑟氏淋球菌实验感染模型,有助于奈瑟氏淋球菌感染机制、疫苗的开发的研究,有助于抗菌药物的筛选与评价.本文将对该实验感染模型研究情况作一综述....
摘要:目的制备人溶菌酶(hLYZ)基因免疫抗体.方法用多聚乙酰亚胺包裹重组质粒pcDNA3LYZ,经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA检测免疫血清中hLYZ抗体的效价,所得抗体用Western-blotting法检测转基因小鼠乳汁中重组hLYZ的表达情况.结果 2次免疫后,小鼠体内产生了hLYZ特异性抗体,效价达1:800,用此抗体为第一抗体在转基因小鼠乳汁中检测到分子量与正常hLYZ相同的重组hLYZ.结论用基因免疫方法在小鼠体内制备了可用于检测的hLYZ抗体....
摘要:为了研究转基因小鼠乳腺表达的重组人溶菌酶(rhLYZ)的理化特性及抑菌活性,将适当稀释的含rhLYZ的母鼠乳汁置于60,72,85,100℃的水浴中,每隔0,1,3,5,10,15,20,30min取样,用微球菌溶解法测定rhLYZ的热稳定性;将稀释乳样的pH值调节为2.0,4.0,5.0,7.4,9.0和10.0,37℃作用30min后检测乳样中rhLYZ的活性;将不同的金属离子加入乳样中,使其终浓度为10mmol/L,然后测定金属离子对rhLYZ活性的影响;用培养的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌涂布琼脂平板,以平板扩散法检测乳样中rhLYZ抑菌谱,在此基础上挑选敏感菌株进行定量抑菌试验.结果表明,转基因小鼠乳腺表达的rhLYZ与人乳中天然hLYZ都具有很强的热稳定性、相似的pH值活性范围和金属离子敏感性,对多种革兰阳性及阴性细菌具有不同程度的抑菌作用....
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