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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:为了高效、持续的诱导获得并培养山羊诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),本研究从饲养层和培养液方面进行优化.将分离获得3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×105 mL-1 MEF、1×105mL-1GEF、5×104mL-1MEF+5×104 mL-1 GEF的密度接种,以高糖DMEM+20%胎牛血清(FBS)和KnockoutD-MEM+20%血清替代物(KSR)为培养液,研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响.结果显示,山羊iPS细胞在接种密度为5×104mL-1MEF+5×104 mL-1GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20% KSR组合的培养液,山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后的克隆形成率均极显著高于其他5组(P<0.01).对该组培养的山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性;Oct4、SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81免疫荧光检测呈阳性;RT PCR检测有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog基因的表达;体外能分化形成类胚体.结果表明,将细胞接种在密度为5×104mL-1MEF+5×104 mL 1GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR的培养液更适合山羊iPS细胞的获得和培养.本试验为山羊iPS细胞的体外研究、临床试验、动物基因组修饰和山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的建系奠定基础....
摘要:旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制.采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到pEGFP-N1和pGL3-Basic载体,构建重组载体.将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化.双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370 ~-36 bp,在-370 ~-166bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著.本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考....
摘要:试验旨在探究不同注射部位和剂量对鸡胚孵化率及发育的影响,为鸡胚注射试验提供帮助和指导.以新鲜受精鸡蛋为材料,分别在鸡蛋的尖端、赤道面和钝端注射不同剂量的生理盐水,比较不同注射部位和剂量对种蛋孵化率的影响;分别在3个位置注射台盼蓝染液,观察记录鸡胚的发育情况.结果表明:不同注射部位对种蛋孵化率无显著性影响(P>0.05);种蛋孵化率随注射剂量的增加明显下降,注射100 μL剂量的种蛋孵化率明显高于其他剂量水平.不同注射位置和剂量的生理盐水对鸡胚发育的影响并不显著;台盼蓝注射后胚胎发育情况表明,在胚胎发育初期赤道面注射的扩散效果最好....
摘要:本研究利用精原干细胞介导法体内转染重组载体pVITRO2-Mx-NA以生产抗病转基因鸡.采用睾丸注射法将脂质体包裹的线性化质粒通过随机打点注射入公鸡睾丸,采集25、50、60、70d后试验公鸡的精液,提取基因组DNA,采用常规PCR检测外源Mx-NA联合基因的整合;转染后60d采集阳性公鸡精液人工授精母鸡,采用PCR和Western blot方法检测后代血液中外源NA-Mx联合基因的表达情况.结果表明:PCR检测证实外源Mx-NA联合基因已在精子基因组中表达,精液PCR阳性率为33.33%(2/6),且能通过体外受精在后代中检测到,后代PCR检测的阳性率为31.43%(11/35),Western blot检测F1代阳性率为28.6%(10/35).以上结果证明外源Mx-NA基因能稳定整合到鸡的基因组中,表明睾丸注射法是一种操作简单、有效的制备抗病转基因鸡的方法....
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CSTPCD 北大核心
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摘要:随着人类测序技术的发展成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用.基因编辑技术主要是通过在外源DNA靶位点上产生双链切口,从而诱导出同源重组修复或非同源末端连接,进而实现基因组的编辑.目前ZFN和TALEN技术被广泛运用,虽然在一定程度上获得明显的效果,但因设计复杂,成本较高,使其运用有所局限.CRISPR/Cas技术近年来凭借其高效、精确的编辑成为最新一代的基因编辑技术.本文就以上3种基因打靶技术的作用原理、应用及优缺点作简单概述,为基因编辑的实践应用提供理论基础....
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要.为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus) FGF8的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能.根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到pGMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1.以qRT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的shRNA载体进行慢病毒包装.在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用qRT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率.结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为shFGF8-1、shFGF8-2、shFGF8-3,其中shFGF8-2干扰效率最佳.将shFGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×108 TU/mL、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体.对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P<0.01),PGC标记基因Cvh C-kit表达极显著上调(P<0.01).此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4d后对照组比较,FGF8低表达使CVH+PGCs比例显著增加(P<0.01).本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参调控PGCs的形成....
摘要:旨在研究视黄酸(All-trans retinoic acid,RA)及Stra8(Stimulated by retinoic acid gene 8)基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs)分化的影响.选用PCR方法鉴定雄性cESCs为研究对象,转染Stra8基因,对Stra8基因阳性cESCs使用RA进行12 d连续诱导,同时设立Stra8基因转染组、RA诱导组及空白组对照,各组均进行3次重复试验.细胞形态学、qRT-PCR检测RA及Stra8基因对cESCs分化的影响.结果表明,转染Stra8基因进行RA诱导,在诱导12 d后,出现精原干细胞样的圆形小克隆,其他组cESCs出现类胚体或解体;qRT-PCR鉴定发现各组中干细胞标记基因表达量随着培养时间的延长逐渐下降,同时检测到生殖细胞相关基因表达,转染Stra8基因并使用RA诱导组中表达量均高于对照组(P<0.01),6d表达量达到最高,然后逐渐下降.Stra8基因和RA的联合作用能够促进cESCs向着生殖细胞方向的分化,不仅改变了原有细胞形态,同时出现了生殖相关基因的表达.通过该方法可以在体外建立一个ESCs诱导分化模型,将为生殖细胞的发生、增殖、分化及调控机理的研究和人类不孕不育症的治疗奠定良好的基础....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE? T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:①前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”:以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”:以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化:按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA(EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg)和脂质体2000的比例为1?0.5、1?1.0、1?1.5、1?2.0以及在最佳总mRNA脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组(P<0.05),且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组(山羊成纤维细胞正常生长组)。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。...
摘要:本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制.根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249 bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测.结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1 bp区域的启动子活性最强,-402~+1 bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域.进一步研究发现,-1 334~-971 bp、-587~-147 bp区域存在正调控元件,-1 976~-1 334 bp、-971~-587 bp区域存在负调控元件.TSA和NFAT1均能增强PMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低.本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础....
摘要:本研究比较了层粘连蛋白(laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、胶原蛋白(collagen)以及睾丸支持细胞(sertoli cell)4种不同培养系统对鸡(Gallus gallus)精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)体外增殖的作用效果.采用三酶两步消化法分离SSCs,细胞经明胶差速纯化后培养,将传至3代的SSCs重新接种于层粘连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白包被的培养皿中以及睾丸支持细胞制备的饲养层上,通过形态学、5-乙基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖、qRT-PCR技术检测不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖的作用效果.结果表明,鸡SSCs的碱性磷酸酶(AKP)阳性克隆数在睾丸支持细胞组最高,达到每视野(32±3)个,层粘连蛋白组、纤维连接蛋白组和胶原蛋白组分别为(26±3)、(24±2)和(23±2)个,三组差异不显著(P>0.05); EDU检测睾丸支持细胞组细胞增殖率为(92.82±2.15)%,显著高于三组基质蛋白组(P<0.01); qRT-PCR结果显示,增殖标记基因原癌基因(myconcogene,c-myc)、Kruppel样因子4(kruppel-like factor 4,Klf4)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在睾丸支持细胞组的表达量最高,其次为层粘连蛋白组,c-myc和Klf4在纤维连接蛋白组中的表达要高于胶原蛋白组,PCNA则相反.实验结果表明:三组基质蛋白及睾丸支持细胞都能够促进鸡SSCs的体外增殖,其中睾丸支持细胞作用最佳,其次为层粘连蛋白,纤维连接蛋白和胶原蛋白两者作用效果差异不显著.该结果为进一步优化鸡胚SSCs的体外培养体系,阐明生殖细胞增殖机制提供了实验基础和理论支撑....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测.同时用Oct4启动子-1516~+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性.结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游-1516~+30 bp,基本活性区域为-238~+30 bp;在-1516~-946 bp、-615~-96 bp区域存在正调控元件,在-1936~-1516 bp、-946~-615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μtmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;-1516~+30 bp片段能够启动GFP的表达.研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础....
摘要:旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza 2'-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据.PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48 h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对Nanog基因启动子活性的影响.选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测.结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5 Azadc+ TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高Nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性....
摘要:将受体种蛋分为3组,分别经换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗后,比较3种开窗方法对孵化率的影响;分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs,比较显微注射时3种不同的处理方法对孵化率的影响;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测.结果表明:赤道面开窗法的孵化率显著高于换壳法和钝端开窗法(P<0.01);开窗后,显微注射经转染的ESCs组孵化率显著低于其他2组(P<0.01);PCR检测结果显示,有四只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中两只鸡的性腺发生EGFP基因的嵌合.表明赤道面开窗后,对受体鸡胚下腔显微注射经转染的ESCs可以生产嵌合体鸡,产生嵌合体鸡的效率为4.17%....
摘要:试验分别探讨了睾酮和FSH诱导鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果.首先筛选睾酮和卵泡刺激素(FSH)的适宜诱导浓度,在RA和支持细胞的诱导基础上分别添加适宜浓度的睾酮和FSH对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果显示:睾酮和FSH的适宜诱导浓度分别为15 ng/mL和25 ng/mL,单独使用睾酮和FSH诱导均未出现类SSCs样细胞;二者联合支持细胞和RA诱导,诱导2d出现类胚体,随后类胚体体积逐渐变大,诱导12d类胚体解体出现类SSC样细胞;实时荧光定量PCR结果显示,睾酮和FSH分别支持细胞和RA共同诱导组中,Stra8表达量持续上调,integrinβ1、Dazl表达量显著上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下降趋势;睾酮的多因素诱导组中,Dazl的表达量明显高于RA和支持细胞诱导组;而FSH的多因素诱导组中Stra8的表达量相对于RA和支持细胞诱导组也显著升高.结果表明睾酮和FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但可以促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:[目的]探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据.[方法]采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO (web gene ontology)和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-qPCR (Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并RNA-Seq (RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8,Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖标记基因表达变化情况.[结果]在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势其在RNA-Seq中的结果一致.体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、azl、integrinα 6和integrin β1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Daz1、integrinα6和in tegrinβ1等生殖标记基因的mRNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓慢;RA+抑制剂组中,2和4d内无类胚体出现,细胞增殖缓慢,6d出现小的类胚体,8d类胚体数量少量增多,且体积稍显增大,10d类胚体开始裂解.并且经过抑制剂的掷制后,NOS2及C-kit、Cyh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖标记基因的表达量在RA诱导组、抑制剂组和RA+抑制剂组中相对于对照组均呈显著性或极显著性的下调趋势.[结论]基于RNA-Seq技术及生物信息学方法筛选出ESCs向雄性生殖细胞分化过程中精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2的基础上,通过对NOS2基因在鸡体内和体外的抑制,发现NOS2在被抑制后,ESCs向雄性生殖细胞分化的过程受到抑制.说明了精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2对ESCs向雄性生殖细胞分化过程中起到重要的调节作用....
摘要:本研究旨在建立猪精原干细胞(Porcine spermatogonial stem cells,pSSCs)体外分离和诱导分化,并探索pSSCs定向分化及分化过程中关键基因的表达情况.采用差速贴壁法分离pSSCs和支持细胞(Sertoli),采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞特性;传至3代后通过添加不同诱导剂,诱导SSCs向脂肪细胞、神经元样细胞和成骨细胞分化,并通过生化染色、qRT-PCR和免疫细胞化学检测诱导效果.结果表明:分离得到的pSSCs在饲养层上生长良好,碱性磷酸酶(AKP)及SOX2、integrinα6、SSEA1、Dazl抗体鉴定均呈阳性,表明SSCs处在未分化状态.诱导8d后,甲苯胺蓝染色及NSE抗体鉴定成阳性,成功诱导SSCs为神经元样细胞;诱导16d后,ALP、Von Kos-sa染色及Collagon l抗体鉴定均呈阳性,诱导SSCs为成骨细胞;诱导22 d后,油红O染色可见脂滴被染成红色,诱导SSCs成为脂肪细胞.在SSCs诱导过程中,qRT-PCR结果显示,Nestin和ptubulin在6d左右表达量最高,Cb凡1和Osterix在12 d左右表达量最高,PPARγ和C/EBPα在18 d左右表达量最高.本研究成功分离获得pSSCs,并且pSSCs可分别定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,表达细胞特有标记基因....
摘要:饲料是养猪业中最重要的部分,其成本高低决定了现阶段养猪业经济效益的多少。为了降低养猪业饲料成本,获取最大的经济效益,开发新型、节约型的饲料成为首要选择。据此,在阐述了资源节约型饲料概况的基础上,对其营养调控技术、配方设计原则和要求进行了总结,并详细介绍了其加工工艺。...
摘要:本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系.在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFP-hTERT,并利用FuGENE(@)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cESCs,添加10 μmol·L 1维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cESCs,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平.结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP-hTERT转染的DF 1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP-hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>o.05).综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80% BRL CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立....
摘要:文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果.首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.筛选出适宜的FSH浓度为25 ng/mL.单独使用FSH诱导,未出现类SSCs样细胞;FSH支持细胞诱导至第6天出现类胚体,至第12天,出现少量精原样细胞;FSH联合支持细胞和维甲酸(RA)进行诱导,至第2天出现类胚体,第12天出现类SSC样细胞.实时荧光定量PCR结果显示,FSH+支持细胞组、FSH+支持细胞+RA组中,Stra8、integrinβ1、Dazl表达量都持续上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势.添加FSH的诱导组中Stra8的表达量相对于各对照组上调显著.FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但具有促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是广泛存在于动物细胞中的一类非编码蛋白序列,在动物机体发育过程中起到了重要的调节作用,并且lncRNA 作用机制在许多的哺乳动物细胞中已经被鉴定。然而,鸡作为一个拥有取材方便、数量庞大等优点的模式动物,其lncRNA 的作用机制尚不明确。这里,我们运用RNA-Seq 技术对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和精原干细胞(Spermatogoniastemcell,SSC)三种细胞进行测序分析,筛选出显著性差异以及特异性表达的lncRNAs,使用qRT-PCR 对测序结果验证,同时对候选lncRNAs 进行靶基因预测以及lncRNA 靶基因的网络互作分析。结果表明在三组细胞中共存在9657 个lncRNAs,其中3549 个差异显著。通过筛选,三组细胞中差异极显著以及特异性表达的lncRNAs 共有20个,qRT-PCR 结果显示这些lncRNAs 的表达趋势RNA-Seq 中一致。同时,通过靶基因预测,共预测出25 个cis 靶基因和6 个trans 靶基因,其中的TRIM8、HAT1、CNAQ 和LYSMD3 存在于RNA-Seq 结果中。我们的研究初步揭示了lncRNA 对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制,拓宽了lncRNA 动向机制的研究层面,为鸡lncRNA 的研究奠定了理论基础。
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