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摘要:目的:观察平喘汤对哮喘大鼠肺组织嗜酸性粒细胞(EOS)凋亡及Bax蛋白表达的影响,探讨平喘汤治疗哮喘的相关机制.方法:SD大鼠随机分为模型组、地塞米松组、正常组和平喘汤低、中、高剂量组.除正常组,其余各组大鼠以卵清蛋白(OVA)致敏、激发制备哮喘大鼠模型.于第1次哮喘激发(造模第21天)开始各组连续灌胃给予相应药物或生理盐水14d.观察各组大鼠一般状况、肺组织病理形态,DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL)测定肺组织EOS原位表达;免疫组化法(Western blot)检测Bax蛋白表达.结果:与正常组比较,模型组大鼠肺组织有明显的病理变化,肺组织EOS呈强阳性表达(P<0.01),Bax蛋白表达量明显减少(P<0.01).经药物干预后,各治疗组哮喘症状有所减轻,肺组织病理变化呈不同程度的改善.各治疗组大鼠肺组织EOS表达明显低于模型组(P<0.01或P<0.05),Bax蛋白表达明显高于模型组(P<0.01或P<0.05),其中平喘汤高剂量与地塞米松改善效果更为明显,且其改善效果相当.结论:平喘汤能够通过促进Bax蛋白表达,诱导EOS凋亡以减少肺组织炎性细胞浸润,进而缓解哮喘气道炎症....
摘要:目的 探讨Delta-like配体4(Delta-like ligand 4,DLL4)在胃癌中的表达情况及对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响.方法 RT-PCR验证胃癌细胞中DLL4 mRNA的表达.构建DLL4-RNAi质粒转染胃癌AGS细胞,0.2μg/mL嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株.MTT检测细胞株细胞增殖情况;划痕实验观察细胞株细胞的迁移情况.结果 RT-PCR结果显示,DLL4和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) mRNA在胃癌AGS细胞中的表达高于正常细胞GES-1中的表达(均P<0.05),且DLL4与VEGF mRNA的表达呈正相关(r=0.617,P=0.032).DLL4-RNAi (34251)和DLL4-RNAi(34253)质粒转染可抑制胃癌AGS细胞DLL4mRNA的表达(均P<0.05).DLL4-RNAi (34251)可抑制VEGF mRNA的表达(P<0.05).MTT实验结果显示,转染DLL4-RNAi (34253)和DLL4-RNAi(34251)的AGS细胞增殖速率减慢(均P<0.01).划痕实验结果显示,转染DLL4-RNAi(34253)的AGS细胞的迁移率降低(P<0.01).结论 胃癌AGS细胞中DLL4表达上调,并影响细胞的增殖和迁移....
摘要:目的 探究肝肾阴虚型类风湿关节炎患者骨质疏松的发生情况,从相关实验室指标分析其相关性并预测继发性骨质疏松的危险因素及发生情况.方法 选取符合标准的肝肾阴虚型类风湿关节炎的病人.进行常规血细胞分析、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、类风湿因子(IgARF IgMRF,IgGRF)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP抗体)检测、骨代谢指标检查和骨密度(BMD)检查.使用多种统计学方法分析其相关性并预测危险因素.结果 共选取符合标准的肝肾阴虚型RA患者64人.其中骨质疏松患者共30人,占46.88%.明显较湿热痹阻型RA发生率(18.18%)高.BMD与抗CCP抗体数值相关,骨质疏松的患者抗CCP抗体较高;血红蛋白数值与BMD有关,骨量正常组的血红蛋白数值较高.急性炎症指标与PTH水平呈显著负相关关系,IgMRF、抗CCP抗体、PTH水平与髋部BMD水平呈现明显的负相关关系.年龄大于65岁患者较其他患者髋部骨质疏松的风险多约一倍;血沉异常患者的腰椎及髋部骨质疏松的发生率均为血沉正常患者的10倍左右;抗CCP抗体高滴度患者腰椎骨质疏松的发生率为其他患者的7倍、髋部骨质疏松的发生率为其他患者的9倍余.结论 年龄、ESR、抗CCP抗体水平与BMD值关系密切,均为继发骨质疏松的危险因素,其中年龄大于65岁,ESR、抗CCP抗体水平较高、血红蛋白水平较低的RA肝肾阴虚型患者,即RA控制不佳的肝肾阴虚型患者更易患继发性骨质疏松....
摘要:支气管哮喘(哮喘)是由多种炎性细胞和炎性介质参与的气道慢性炎症性疾病.调查显示,目前全球哮喘人数己超过5%,且患病率与病死率均有持续上升的趋势,严重影响患者的身心健康[1].吸入性皮质类固醇激素和β-2激动剂常作为哮喘患者的一线治疗药物[2],但存在价格较高、治疗周期长、副作用明显或停药后症状加重等问题[3].平喘汤为临床经验方,是以三子养亲汤为基础,配合宣肺、平喘等药物加减而成.既往的临床研究表明,本方可以改善支气管哮喘患者急性发作期的肺功能[4].本实验通过研究平喘汤对哮喘大鼠嗜酸性粒细胞(EOS)凋亡及Bax蛋白表达的影响,探索本方防治哮喘的机制.
摘要:目的 探讨蜂毒素对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制.方法 MTT法检测蜂毒素对小鼠结肠癌CT-26细胞增殖的影响;Transwell小室实验检测蜂毒素对CT-26细胞迁移能力的影响;流式细胞技术检测蜂毒素对CT-26细胞凋亡的影响;Western Blot检测经蜂毒素作用后的CT-26细胞中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平.结果 Transwell小室实验显示,经1μg/ml、2 μg/ml蜂毒素处理过的CT-26细胞穿膜数明显减少并呈一定的浓度依懒性(P<0.01).流式细胞技术检测显示,经1μg/ml、2μg/ml蜂毒素处理过的CT-26细胞凋亡率明显提高并呈一定的浓度依懒性(P< 0.01).Western Blot结果显示,经1μg/ml、2μg/ml蜂毒素处理过的CT-26细胞,Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白的表达水平明显降低(均P< 0.01).结论 蜂毒素能明显抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的增殖与迁移,促使细胞的凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关....
摘要:消化系肿瘤在我国是最常见的恶性肿瘤,随着现代生活节奏的加快,消化系肿瘤的发病率有增高趋势,年轻化的趋势也愈加明显.减毒沙门氏菌作为一个胞内寄生菌,本省具有抗肿瘤特性,同时可以作为肿瘤基因治疗的载体进行抗肿瘤治疗.本文就减毒沙门氏菌及作为治疗载体在肝癌、胃癌、大肠癌的体内外应用进展进行综述....
[硕士论文] 朱晓舟
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第三位,近年来,结肠癌的发病率与病死率在中国呈上升的趋势,达到或超过了西方发达国家的平均水平,其发病年龄在40岁以上,高发年龄普遍在50~60岁,比西方国家平均提早10岁。目前结肠癌临床治疗主要以手术为主,同时有目的的结合放疗和化疗。结肠癌5年生存率为74%,根治手术率为85%。但是对于有些失去手术机会,又不能耐受化疗毒副作用的患者,迫切需要寻找或开发出新型的抗肿瘤药物。蜂毒是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的透明毒液,民间利用蜂毒治疗类风湿性关节炎已有悠久的历史。蜂毒素是从蜂毒中提取的一种小蛋白分子,约占蜂毒干重的50%,具有很强的生物活性。随着现代分子生物科学技术的发展,基因工程蜂毒素技术已经很成熟,并通过体内外实验,验证其具有生物学活性。蜂毒素具有抗肿瘤作用,能抑制消化道肿瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。国内外关于蜂毒素抑制肿瘤细胞增殖、转移,诱导凋亡的研究尚未完全阐明,课题组前期研究发现蜂毒素能通过线粒体通路抑制胃癌细胞转移,诱导胃癌细胞的凋亡,本研究拟通过细胞、分子、动物水平探究基因工程蜂毒素给药的最佳药物浓度及治疗效果,旨在探讨蜂毒素体内外抑制结肠癌的机制。
  研究内容分为三部分:
  第一部分 天然蜂毒素抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的实验研究
  目的:通过不同浓度的蜂毒素抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,探讨蜂毒素对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制。
  方法:MTT法检测不同浓度蜂毒素(1、2、4、8和16μg/mL)分别作用小鼠结肠癌CT-26细胞不同时间(1、2、4、8h)后细胞增殖情况;Transwell小室实验检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用小鼠结肠癌CT-26细胞1h后迁移能力的情况;流式细胞术检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用CT-26细胞1h后诱导细胞凋亡情况;Western Blot检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用1h后小鼠结肠癌CT-26细胞线粒体通路中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平。
  结果:MTT结果显示蜂毒素能够有效抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,随着浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增高,趋近100%,当蜂毒素浓度分别为1和2μg/mL作用1h,抑制率分别达到24.83%、58.16%,与对照组相比差异显著(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,经1和2μg/mL蜂毒素处理细胞1h后,CT-26细胞穿膜数分别为192个和53个,较对照组207个明显减少,并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,经1和2μg/mL的蜂毒素处理后1h,CT-26细胞凋亡率分别为8.5%、11.3%,较对照组凋亡率5.3%明显升高并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。Western Blot结果显示,经1和2μg/mL蜂毒素处理小鼠结肠癌CT-26细胞1h后,细胞上清中,Caspase-9相对表达量分别为1.07和0.46,较对照组2.25明显降低,呈一定的浓度依赖性(P<0.01),Caspase-3相对表达量分别为3.72和2.33,较对照组11.03明显降低,呈一定的浓度依赖性(P<0.01),PARP相对表达量分别为1.23、1.10,较对照组1.80明显降低,并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。
  结论:当蜂毒素浓度分别为1、2μg/mL,作用小鼠结肠癌CT-26细胞1h后,就能明显抑制细胞的增殖、迁移、并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关。
  第二部分 携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌体外抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的实验研究
  目的:通过不同浓度的各组菌抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,探讨携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌(Mel菌)对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制。
  方法:MTT法检测不同浓度的Mel菌及减毒沙门氏菌(X4550菌)、携带荧光基因的减毒沙门氏菌(GFP菌)(15、20、25、30、35、40、45和50CFU/细胞)分别作用小鼠结肠癌CT-26细胞24、48h后细胞增殖影响;Transwell小室实验检测Me1菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用小鼠结肠癌CT-26细胞24h后迁移能力的情况;流式细胞技术检测Mel菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用CT-26细胞24h后诱导细胞凋亡的情况;Western Blot检测经Mel菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用24h后的小鼠结肠癌CT-26细胞线粒体通路中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平。
  结果:MTT结果显示各组菌均能够有效抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,随着浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增高,趋近100%,当Mel菌浓度为25CFU/细胞时,抑制率为50.26%,当X4550菌浓度为45CFU/细胞时,抑制率为50.12%,,当GFP菌浓度为30CFU/细胞时,抑制率为50.02%,作用时间均为24h,与对照组相比差异显著(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理24h后的CT-26细胞穿膜数为41.8个,较对照组161.8个明显减少并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理24h后的小鼠结肠癌CT-26细胞凋亡率为13.98%,较对照组5.73%明显提高并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。Western Blot结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理小鼠结肠癌CT-26细胞24h后,细胞上清中,Caspase-9,Caspase-3和PARP的相对表达量分别为0.43、0.37、0.44,较对照组1.91、1.3、2.2明显降低,呈一定的浓度依赖性(P值均<0.01)。
  结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌(Mel菌)具有天然蜂毒素的活性,当其浓度为25CFU/细胞,作用小鼠结肠癌CT-26细胞24h后,就能明显抑制细胞的增殖、迁移、并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关。
  第三部分 携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌治疗小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型的实验研究
  目的:观察携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌治疗小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型的效果。
  方法:60只BALB/c小鼠购回后适应性饲养1周,除正常组外,所有小鼠以右侧腋窝皮下注射小鼠结肠癌CT-26细胞悬液浓度为3×106/0.1ml/鼠的方法诱导制作小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型。细胞悬液注射后,每天检查小鼠右侧腋下,有肿大质硬的肿块,确定造模成功。按随机数字法将其分为模型组,对照组X4550菌组,对照组GFP菌组,Me1菌组,阳性药物人参皂苷对照组(Rg3)。成瘤后每3天细菌组(X4550菌组、GFP菌组、Mel菌组)分别给小鼠灌胃,1×106CFU/0.2ml/鼠;Rg3组每日灌胃Rg3,剂量是0.1mg/kg/0.2ml/鼠;正常组及模型组均灌胃,0.2ml/鼠生理盐水,每3天灌胃后测量小鼠体质量、测量肿瘤长和宽、记录小鼠一般情况。给药4周后,于末次给药12h后摘眼球取血法收集血样,ELISA法检测相关因子(IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ);RT-PCR检测小鼠肿瘤组织中VEGF、KDR和p53mRNA的表达。
  结果:肉眼观察可见,除正常组外,其他各组小鼠均成功荷瘤,通过小鼠肿瘤测量计算体积比较后发现,给药组小鼠的肿瘤体积均得到缓解,其中Mel菌组小鼠肿瘤体积增长程度慢于其他组(P<0.01);ELISA检测小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ等细胞因子发现,Mel菌组小鼠各项免疫学指标改变优于其他组(P<0.01);各治疗组与模型组相比较,VEGF、KDR mRNA基因的相对表达量下调(P<0.01),p53mRNA基因相对表达量上调,差异具有统计学意义(P<0.01)。
  结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌具有天然蜂毒素的活性,能有效缓解荷瘤小鼠肿瘤的生长,通过调控IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ等细胞因子的表达及抑制VEGF/KDR通路中关键信号分子的激活和激活抑癌基因p53的表达来达到抑制肿瘤生长。
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