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青岛大学
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[硕士论文] 朱晓文
微生物学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:高盐、高压、低温、低氧和寡营养等极端环境造就了海洋链霉菌独特的代谢方式,使其次级代谢产物丰富多样进而成为新型活性物质的重要来源。分离自青岛胶州湾的海洋链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus)菌株M045能够产生手霉素A、中尼霉素A和B等多种抗生素。其中,中尼霉素A是由前体物质手霉素A经辅酶依赖型氧化还原酶CHIE4催化合成。研究表明中尼霉素可抑制黑色素瘤与乳腺癌的发生,并对农作物病原真菌具有抑制活性,因而具有较高的研究与应用价值。
  本课题采用多种蛋白表达系统对来自海洋链霉菌菌株M045的CHIE4进行了体外重组表达研究。结果表明,由原核表达载体pET28表达的CHIE4会形成包涵体,通过透析和复性等处理能够获得可溶性的CHIE4,但是活性检测发现该CHIE4的催化活性基本丧失。利用原核表达载体pMAL-p5x和pMAL-c5x可获得与麦芽糖结合蛋白标签融合表达的可溶性CHIE4。该融合蛋白经MBP亲和层析、TEV蛋白酶酶切和Ni柱串联亲和层析可得到纯化的单一CHIE4,活性检测实验证实该CHIE4具备催化活性。实验同时证实利用真核表达载体pPIC9K和毕赤酵母表达系统无法获得CHIE4的表达。
  辅酶依赖型氧化还原酶CHIE4的编码基因GC含量高达65%,原核表达易形成包涵体,变性复性后蛋白又极易失去催化活性,为CHIE4的生产应用带来挑战。本研究利用麦芽糖结合蛋白标签融合表达系统,经蛋白酶切和串联亲和层析获得了具有催化活性的CHIE4,为实现CHIE4的大规模应用和中尼霉素的工业化生产奠定基础。
摘要:在大肠杆菌中进行了藻胆蛋白的重组表达,对重组藻胆蛋白进行了分离纯化,测定了重组藻胆蛋白的光谱学性质和抗氧化活性.结果表明,以IPTG为诱导物时,当菌液OD600为0.95时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG和5.0 mmol/L的5-氨基酮戊酸(ALA),在18℃条件下诱导24 h重组蛋白可获得较好表达效果,表达量达149.5 mg/L;以乳糖为诱导物时,当菌液OD600为1.2时,加入终浓度为1.0 g/L的乳糖和5 mmol/L的ALA,在18℃条件下诱导26 h重组蛋白可获得较好表达效果,表达量达102.9 mg/L.重组藻胆蛋白最大吸收峰位于550 nm,最大荧光发射峰位于562 nm,相对于IPTG诱导表达的重组藻胆蛋白,经乳糖诱导表达重组藻胆蛋白,其550 nm处具有较强的光吸收,562 nm处具有较高荧光强度,同时也具有较高的羟基自由基和超氧阴离子的清除能力....
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