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摘要:本研究运用RT-PCR及RACE技术首次从中华蜜蜂中分离得到P450家族的一个基因,与意大利蜜蜂中P450家族的336A1基因有较高同源性,命名为Acc336A1。该基因的开放阅读框(ORF)包含1491个核苷酸,编码一个有497个氨基酸,分子量大约为56.95kDa,等电点为8.8的蛋白。分别用不同农药(蚊蝇醚、百草枯)、重金属(氯化汞)及紫外线处理蜜蜂,然后采用定量PCR和Western-blot技术动态检测Acc336A1在mRNA和蛋白水平上的表达模式,通过免疫组化的方法对蜜蜂Acc336A1蛋白进行组织定位分析,为进一步研究细胞色素解毒功能奠定基础。 定量PCR结果显示,Acc336A1基因对紫外线,蚊蝇醚、百草枯和氯化汞均有较明显反应,在处理一段时间后基因的表达量呈现先上升后又略微下降的趋势,并且一直高于对照组,整体是呈现上调表达。表面中华蜜蜂Acc336A1参与对于紫外线、农药、重金属等不良环境的抵御作用。免疫组织化学结果显示,Acc336A1广泛的分布在气孔、体壁表层及眼部周围组织;然而在眼内部却几乎没有Acc336A1的存在。此外,Acc336A1大量印染着腹部表层细胞,胸部背板组织也是Acc336A1分布的主要区域。这些结果表明,Acc336A1主要在中华蜜蜂的表皮部位发挥其解毒作用。
[硕士论文] 朱明
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:细胞色素 P450(P450)是多功能氧化酶的核心酶系,参与昆虫杀虫剂的代谢以及蜕皮激素、保幼激素等激素的合成,与昆虫的生长、发育和防御密切相关。另外,这些酶与过氧化物酶有类似的活性,因此可能在保护生物体免受活性氧损伤的过程中发挥作用。本研究以我国特色种质资源中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为实验材料,根据意大利蜜蜂(Apis mellifera)的同源序列,利用RT-PCR和RACE-PCR的方法从中华蜜蜂中首次克隆得到了P450家族CYP3分支和CYP2分支的CYP336A1和CYP18A1两个基因,并且分别命名为AccCYP336A1和AccCYP18A1。然后进一步对它们进行了序列比对、表达特性分析以及功能预测。具体的结果如下:
  (1)AccCYP336A1开放阅读框全长1491bp,编码一个含有496个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为57kDa,等电点为8.8。AccCYP18A1开放阅读框全长1620bp,编码一个含有539个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为60.7kDa,等电点为8.42。氨基酸序列比对发现,AccCYP336A1、AccCYP18A1与其他物种中P450家族基因的同源性较高,且具有该家族保守的功能区域。进化树分析发现,AccCYP336A1和AccCYP18A1分别属于CYP3分支和CYP2分支。
  (2)采用qRT-PCR的方法分别对两个基因在中华蜜蜂不同发育时期和不同组织部位中的表达特性进行了分析。qRT-PCR结果表明,AccCYP336A1和AccCYP18A1在整个中华蜜蜂的变态发育过程中均有表达,AccCYP336A1在卵期的表达量最高,而AccCYP18A1在变态发育的两个重要发育节点:5日龄幼虫(L5)及1日龄成蜂(A1)时期表达量最高。以上结果表明,AccCYP336A1及 AccCYP18A1可能与中华蜜蜂的变态发育有关。另外,中华蜜蜂不同组织部位中的表达特性显示,AccCYP336A1在表皮中表达量最高,而AccCYP18A1在中肠中表达量最高。这些结果初步表明了两个基因的组织特异性。
  (3)采用qRT-PCR的方法分别对两个基因在不同非生物应激中的表达模式进行了研究。结果表明,AccCYP336A1、AccCYP18A1两个基因的表达受高温、低温、紫外线和杀虫剂等非生物应激的诱导。这些结果表明,这两个基因在中华蜜蜂抗逆、抗氧化过程中起到重要作用。
  (4)采用Western-blot的方法分别对两个基因所编码蛋白在不同非生物应激中的表达特性进行了研究。结果显示,AccCYP336A1、AccCYP18A1两个蛋白的表达受高温、低温、紫外线和杀虫剂等非生物氧化胁迫的诱导,此结果与两个基因转录水平表达特性相一致,进一步暗示了AccCYP336A1和AccCYP18A1在中华蜜蜂抗逆、抗氧化过程中起到重要作用。
  (5)在大肠杆菌菌株中利用纸片扩散实验检测体外AccCYP336A1蛋白的功能。研究发现表达AccCYP336A1蛋白的大肠杆菌对百草枯的抗性显著增强。
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用,对植物的生长发育起重要的调控作用.传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA,采用序列胶分离DNaseI酶切片段,操作较复杂,分辨率较低,不适用于高通量的样品检测.为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制,本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNaseIfoot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA),选用荧光色素代替同位素标记,毛细管电泳技术代替序列胶检测DNaseI酶切片段,判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域.采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果.同时,在判定的GmMYB1结合区域的基础上,选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验,证明GmMYB1可以与相应元件结合.该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠,作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点.
[硕士论文] 朱明
发育生物学 山东农业大学 2011(学位年度)
摘要:DREB(dehydration resistance element binding protein)类转录因子是一类与抗逆相关的转录因子基因,广泛存在于各种植物中,参与调控各种与抗逆相关的功能基因的表达,在逆境胁迫应答反应过程中发挥非常重要作用。但是,目前对DREB基因的研究主要集中在功能分析方面,对其转录水平的调控机制了解比较少。
   本实验室前期已经从大豆中克隆到新的GmDREB3基因,功能研究表明,过表达GmDREB3基因可以显著提高植物的抗逆性。将GmDREB3启动子分段缺失融合GUS报告基因采用基因枪转化小麦成熟胚愈伤组织,利用瞬时表达的方法检测不同长度启动子的活性的方法,对GmDREB3启动子进行初步分析证明,在启动子的-705~-1117bp区域存在着低温和干旱响应的正调控元件,在-1117~-1464bp区域存在着对低温和干旱响应的负调控元件。在此基础上,进一步对这两个重要区域进行了细致分析,结果证明在-705~-731bp区域存在着对低温和干旱响应的正调控MYB元件;-1117~-1269 bp区域存在着对低温和干旱响应起重要作用负调控MYC元件。本研究中我们利用确定的重要调控元件分别构建了诱饵载体,采用酵母单杂交技术,分别筛选与重要调控元件结合的上游调控蛋白:运用MYC元件做诱饵筛选到了GmERF蛋白,运用MYB元件作诱饵筛选到了GmMYB蛋白。我们分别采用酵母单杂交技术和凝胶迁移率实验验证了MYC元件与ERF元件可以和GmERF蛋白结合,MYB元件可以和GmMYB蛋白结合;通过酵母转化验证GmMYB蛋白具有转录激活活性,而GmERF蛋白不具有转录激活活性。通过RT-PCR对低温处理不同时间的拟南芥中的GmERF和GmMYB基因的表达特性进行了分析,发现相对表达量GmMYB呈下降趋势,GmERF呈上升趋势,一段时间后两者的表达量趋于稳定;通过酵母体内的两个蛋白之间的竞争性结合实验证明在GmMYB蛋白和GmERF蛋白表达量一致的情况下,GmERF蛋白先与GmDREB3启动子结合。为了确定GmERF和GmMYB基因的功能,我们分别构建了侵染植物的表达载体,结果分析表明,转GmMYB基因的拟南芥能明显提高植株的对干旱、NaCl等逆境胁迫的能力,转GmERF基因的拟南芥对干旱、盐等的胁迫呈现敏感的趋势。综上所述,在大豆低温处理3h内,GmMYB蛋白与MYB元件结合,激活DREB3基因的表达,从而激活下游抗逆基因的表达;在低温处理24h后,GmERF蛋白与MYC和ERF元件结合,抑制DREB3基因的表达,从而抑制下游抗逆基因的表达。正是由于正调控元件与负调控元件的相互作用使得GmDREB3基因在植物体内的表达水平维持在一个恰当的水平,使植物适应不良的外界环境并正常的生长。
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