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摘要:为克服抗菌肽易被蛋白酶降解及对宿主大肠杆菌的杀伤作用,并进一步提高大肠杆菌系统的表达能力,以棘胸蛙Paa spinosa抗菌肽Spinosan-C为研究对象,按照大肠杆菌密码子利用频率进行密码子优化,设计合成8拷贝的串联8×Spinosan-C基因,将合成的串联基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a,利用大肠杆菌感受态细胞Rosetta进行原核表达,获得高效表达的串联8×Spinosan-C重组蛋白,用甲酸专一性切割得到抗菌肽Spinosan-C单体.体外抑菌试验表明,切割后的抗菌肽Spinosan-C单体对测试菌生长具有抑制作用,为蛙类抗菌肽的规模化制备提供了参考....
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CSTPCD 北大核心
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摘要:Argonaute (AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用.基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择BmAGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础.通过分析BmAGO2蛋白的抗原性分布,筛选出BmAGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体pColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠.剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合.以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3.经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的BmAGO2单克隆抗体.利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞BmN以及家蚕5龄幼虫的内源BmAGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的BmAGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA....
摘要:环形RNA (circRNA)是具有闭合环状结构的单链RNA,其功能涉及对亲本基因转录的调控、miRNA的吸附和作为某些疾病的生物标志物.以家蚕幼虫、蛹和蛾3个发育时期蚕体的混合样本提取总RNA,利用高通量测序共获得112 271 320个测序read.采用软件MapSplice和Find_circ从获得的测序read中预测家蚕的circRNAs,其中用MapSplice预测到的circRNA共l 659条,用Find_circ预测到的circRNA共9 777条,2个软件共同预测到的circRNA有1 598条.利用circRNA预测程序CircRNApredictor.pl从家蚕转录组read(SRR315361)和家蚕基因组序列中预测到12 955条circRNA,进一步将高通量测序read匹配预测的circRNA序列,结果显示序列首尾重叠,为环状分子.通过软件miRanda预测了部分家蚕circRNA的靶miRNA.设计特异性的正、反向PCR引物对,选取其中1 1条SRPBM(spliced reads per billion mapping)值最高的circRNA进行PCR,产物测序鉴定为家蚕潜在的circRNA分子,其中BmcircR_3621、BmcircR_8955、BmcircR_8926、BmcircR 6123、BmcircR_8349、BmcircR_1198、BmcircR_9535、BmcircR_6215、BmcircR_7937在家蚕酪氨酸蛋白激酶Abl(tyrosine-protein kinase Abl)和异常细胞迁移蛋白10(abnormal cell migration protein 10)等的基因序列中以环的形式存在,并且主要成环位点与生物信息学预测结果一致,而BmcircR_2196和BmcircR_6226的成环位点与预测存在差异.研究结果可供家蚕乃至昆虫新型RNA分子的鉴定和研究参考....
[硕士论文] 朱兵
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:Apolipophorin-Ⅲ(ApoLp-Ⅲ)是存在于昆虫血淋巴中的一种转运脂肪的营养储藏类蛋白,其属于载脂蛋白家族,在脂肪体中合成,主要用于脂质的储藏和转运,在免疫反应、炎症的发生及抵抗外部细菌的侵染等方面也起着重要的作用。乙酰化修饰是一种重要的可逆蛋白翻译后修饰,可以调控蛋白与DNA的互作、基因转录、应激反应、新陈代谢和蛋白稳定性等,与糖尿病、癌症和心血管病等多种重大疾病有关联。前期研究发现,家蚕血淋巴中包括ApoLp-Ⅲ(BmApoLp-Ⅲ)的多种营养储藏类蛋白存在大量乙酰化修饰位点,其中乙酰化修饰可以调控其中的SP2和30K-3蛋白的稳定性。基于前期研究,本课题同样开展乙酰化修饰调控家蚕BmApoLp-Ⅲ稳定性的功能研究,为进一步深入研究乙酰化调控家蚕营养储藏和利用的机制打下基础。
  首先利用RT-PCR的方法从家蚕卵巢细胞总RNA中获得了BmApoLp-Ⅲ基因的编码区片段(ORF),将其克隆至改造后的真核表达载体pIEX-1-si-GFP中,获得了重组真核表达载体pIEX-1-si-GFP-ApoLp-Ⅲ。转染家蚕BmN细胞,成功表达出HIS融合的BmApoLp-Ⅲ重组蛋白。利用HIS单抗免疫共沉淀获得纯化的BmApoLp-Ⅲ蛋白,乙酰化单抗进行Western blotting检测,结果表明BmApoLp-Ⅲ存在高度的乙酰化修饰,和前期质谱鉴定结果一致。其次,采用去乙酰化酶抑制剂LBH589和乙酰化酶抑制剂C646分别上调和下调蛋白的乙酰化水平,结果显示,LBH589和C646处理后,BmApoLp-Ⅲ蛋白的表达量分别呈现为上调和下调的趋势,并且在转录水平上并无影响,这一结果表明,乙酰化修饰可以在翻译后水平影响BmApoLp-Ⅲ蛋白的表达和细胞含量。利用CHX和MG132处理细胞,研究乙酰化修饰对蛋白的降解和积累的影响,结果表明,CHX阻断蛋白合成途径后,与对照组相比,乙酰化水平上调可以明显减缓BmApoLp-Ⅲ蛋白的降解,反之,MG132阻断蛋白降解途径后,乙酰化水平的上调可进一步提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的细胞含量,上述结果表明乙酰化水平的上调可以提高BmApoLp-Ⅲ的稳定性。最后开展BmApoLp-Ⅲ蛋白乙酰化与泛素化竞争实验,结果表明,当BmApoLp-Ⅲ乙酰化水平提高后,其泛素化水平降低,反之亦然,乙酰化和泛素化水平呈负相关结果,推测BmApoLp-Ⅲ的乙酰化与泛素化存在竞争关系。综合上述结果表明,乙酰化修饰可以在翻译后水平上调BmApoLp-Ⅲ的蛋白表达和稳定性,其分子机制可能是通过竞争其泛素化修饰,阻滞泛素介导的蛋白酶体降解途径,从而提高蛋白的稳定性和细胞含量。上述结果有望发现家蚕中一种新的调控载脂蛋白稳定性和水解的新机制。
  另外,利用H2O2诱导BmN细胞凋亡,证实BmApoLp-Ⅲ蛋白具有剂量依赖的抗细胞调亡能力,同时LBH589处理细胞后可以进一步显著提高细胞的成活率,而C646却使细胞的成活率显著下降,表明乙酰化修饰可以提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的抗细胞调亡能力。综合前面的研究结果,推测其机制可能是乙酰化水平的上调提高了BmApoLp-Ⅲ蛋白的稳定性和细胞内该蛋白的含量,从而提高了BmApoLp-Ⅲ蛋白的抗细胞凋亡能力。
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