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摘要:旨在为生物脱胶技术提供菌种资源.从不同生境中采集微生物样品,以苎麻原麻和果胶为主要基质,通过富集和选择性培养进行分离、筛选,获得78份具有降解苎麻韧皮胶质功能的细菌资源,通过形态特征、生理生化试验和16S rDNA测序,对菌种进行分类鉴定、种群多样性和聚类分析,初步鉴定为17属,至少27种,再通过脱胶实效法进一步复筛,选出10株代表性菌株,并进行了产脱胶关键酶的初步验证.
摘要:为了探索一种使高效脱胶菌株能够长期保存且易活化的方法,试验采用抽真空法和甘油冷冻法两种方法对保存了3年或10年的菌株CXJZU-120进行苎麻脱胶,定期测定活化菌液和发酵液中相关活化性能指标.结果表明:甘油冷冻法保存3年的菌株经活化10 h,菌体颜色深浅不一;发酵10.5 h,其活菌数为1.66×107 cfu/mL,COD值为3.86 g/L,苎麻脱胶失重率为19.53%,只适合短期保存.然而,抽真空法保存3年、10年的两支菌株经活化10 h,活化菌体颜色均较深;发酵10.5 h,其活菌数均可达1.02×109 cfu/mL,COD值分别为6.02、5.65 g/L,苎麻脱胶失重率均超过27%.因此,抽真空法适合高效脱胶菌株CXJZU-120中、长期保存.
摘要:根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆关键脱胶酶基因:果胶酶基因(pel E)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man),重组到表达载体p ET-28a中,导入E.coli BL21中进行诱导表达.结果表明:pel E核酸序列长1185 bp,编码395个氨基酸,蛋白分子量为44 kDa;xyn核酸序列长1251 bp,编码416个氨基酸,蛋白分子量45.74 kDa;man核酸序列长1137 bp,编码379个氨基酸,蛋白分子量41.85 kDa.果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶的酶活力分别为471.97、64.32、16882.86 U/mL.该研究为进一步发掘DCE-01菌株基因资源及开发高效工业酶制剂提供了科学依据.
摘要:为获得耐热甘露聚糖酶,从天然高温泉水中筛选出了一株产甘露聚糖酶的细菌.结合形态学、生理生化和分子生物学等手段,确定所筛选的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis).并研究了温度、pH值和金属离子等因素对甘露聚糖酶活力的影响.结果显示,该酶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0.Co2+和Al3+对该酶的活力有抑制作用,Mn2+、K+和Ca2+对该酶活力有一定的促进作用,其它离子对酶活力没有显著影响.该菌株生产的甘露聚糖酶具有耐热偏酸性的特点.该研究为甘露聚糖酶制剂产业提供了可靠的菌种资源,可用于纺织、食品、饲料等方面,并为将来进一步研究其用途奠定了基础.
摘要:为阐明大麻韧皮生物脱胶机理,研究采用DCE01菌株对大麻韧皮进行浸泡振荡发酵10.5h,从0.5h开始,每隔2h取样,采用高效液相色谱法分析发酵过程中有机酸的变化规律.结果表明:在降解大麻韧皮发酵过程中发酵液主要含有草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和其它未知有机酸组分.草酸、甲酸、琥珀酸的含量在发酵过程中均呈先升后降的变化趋势,发酵最终变化率分别为降低93.69%、升高65.37%、降低26.01%;乙酸呈先升后降再回升再下降的变化过程,发酵最终变化率为降低84.58%;苹果酸、乳酸含量呈先升后降再回升变化状态,发酵最终变化率分别为升高52.03%、升高31.97%;柠檬酸含量呈缓慢上升至平稳趋势,发酵最终变化率为升高44.31%;丙酸含量呈不规则变化趋势,发酵最终变化率为升高0.11%.
[硕士论文] 曾洁
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:DCE-01是一株“广谱性”、“高效性”脱胶菌,对多种草本纤维原料均能起到很好的脱胶作用,且6.0h能独立完成苎麻脱胶,不需要其他化学方法后处理补充。其脱胶功能的广谱性和高效性在国内外都属于领先地位。本文以DCE-01菌株为研究对象,从DCE-01菌株中克隆出3个关键脱胶酶基因,以2种不同的排列方式将这3个关键脱胶酶基因串联起来,分别在大肠杆菌和DCE-01菌株中表达,获得结果如下:
  1.根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆出关键脱胶酶基因片段3个:果胶酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。经测序及生物信息学分析:pelE核酸序列长1185bp,编码395个氨基酸,预测蛋白分子量为43.8kDa;xyn核酸序列长1251bp,编码416个氨基酸,预测蛋白分子量45.74kDa;man核酸序列长1137bp,编码378个氨基酸,预测蛋白分子量41.85kDa。
  2.通过设计特异引物和PCR扩增获得带有特定限制性酶切位点的关键脱胶酶基因(PelE基因、Xyn基因和Man基因)片段,经酶切并与表达载体pET-28a连接,构建成单基因表达重组子,同时,按照PXM、XPM的顺序串联排列在表达载体pET-28a的MCS区段上,构建成多基因共表达重组子,然后,将单基因表达重组子和多基因共表达重组子导入BL21菌株中,成功构建PelE、Man和Xyn的单基因表达重组菌株(pET-28a-P/BL21、pET-28a-M/BL21和pET-28a-X/BL21)和多基因共表达重组菌株(pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21)。
  3.将构建的重组子转入到DCE-01(关键脱胶酶基因来源菌株)中,成功获得单基因同源表达的重组菌株3个,包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01,多基因同源共表达的重组菌株2个,即pET-28a-PXM/DCE-01(或DCE01PXM)和pET-28a-XPM/DCE-01(或DCE01TM)。
  4.对BL21系列重组菌株的酶活测定结果显示:(1)pelE重组菌株所表达PelE酶活为471.97U/mL,而把pelE排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21时,对应的PelE酶活分别是532.68U/mL和121.43U/mL。(2)xyn重组菌株所表达Xyn酶活为44.32U/mL,而把xyn排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21时,对应的Xyn酶活分别是47.43U/mL和31.42U/mL。(3)man重组菌株所表达Man达16882.86U/mL,而将man排在远离启动子位置形成的pET-28a-PXM/BL21与pET-28a-XPM/BL21时,对应的Man酶活分别为645.21U/mL和230.83U/mL。因此,可以推论:(1)用于构建多基因共表达体系的载体的启动子对pelE的表达效果有显著促进作用;(2)构建多基因共表达体系时,目的基因的表达效果与插入位点离启动子的距离呈负相关,即距离越远效果越差;(3)在多基因共表达体系中,man的表达效果受pelE插入位点的影响突出。
  5.以DCE-01和DSM18020(模式菌株)为对照,对多基因同源共表达重组菌株纯培养液的酶活测定结果显示:(1)重组菌株DCE01PXM、DCE01XPM的PelE酶活性分别是DCE-01菌株的2.77倍、1.01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重组菌株DCE-01PXM、DCE-01TM的Xyn酶活性分别是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重组菌株DCE-01PⅪM、DCE-01XPM的Man酶活性分别是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出结论:采用基因串联方法将来自DCE-01菌株的关键脱胶酶基因(pelE、xyn、man)整合到表达载体(pET-28a)中形成重组子,无论是导入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)还是导入DCE-01菌株都获得了成功表达,而且多基因同源共表达重组菌株表达PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。
  6.液相色谱分析DCE-01、DSM18020、DCE-01PXM、DCE-01XPM菌株用于苎麻脱胶发酵液的结果表明:DCE-01PXM菌株的发酵液中检测到的单糖含量要明显高于其他几个菌株,DCE-01PXM菌株发酵液中的单糖含量略高于DCE-01菌株,而DCE-01菌株脱胶发酵液的单糖含量要明显高于DSM18020菌株。这一结果与上述酶活检测结果基本一致,说明将DCE-01关键脱胶酶基因按照PXM的顺序串联排列形成重组子后导入DCE-01中进行多基因同源共表达的方法,能在一定程度上提升DCE-01的脱胶功能。
摘要:为阐明草本纤维植物的非纤维素物质生物降解机理,采用高效脱胶菌株DCE01对大麻韧皮进行浸泡振荡发酵,利用平板活菌计数法、DNS法、COD测定法、柱前衍生-高效液相色谱法检测发酵液中生物降解非纤维素物质相关数据的变化趋势。结果表明:发酵液中DCE-01活菌量随发酵时间延长而增加,6.5h以后的增幅变缓;果胶酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶的催化活性在发酵过程中逐渐增大,在10.5 h时最大,依次为411.4 IU/mL、521.4 IU/mL和45.6 IU/mL;COD值以及酶降解产物鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖等单糖类组分的含量均随发酵时间延长而增加,而甘露糖被DCE01菌株用作碳源,其含量在19.8~23.6μg/mL之间小幅度变化,葡萄糖含量则随发酵时间延长呈现两次先升后降的变化规律。
摘要:苜蓿作为一种优质豆科牧草因其产量高、品质好而被广泛种植,逐渐发展成为促进我国经济发展的草产业.我国苜蓿产业起步较晚,在栽培育种、调制加工、安全贮藏等环节还有需要改进的空间.本研究结合我国苜蓿产业发展概况,重点剖析发展中存在的问题,提出助力我国苜蓿产业发展的措施,旨在促进我国苜蓿产业健康发展.
摘要:从麻类脱胶高效菌株DCE01中克隆出一个果胶酶基因Pel4I8,采用表达载体pET-28a,在E.coli BL21 (DE3)中成功表达.实验结果表明,底物(橘子果胶)的酯化度对酶活有较大影响,用酯化程度在55%-70%的橘子果胶作底物时酶活最高(酶活为17.5U/ml);胞内酶最适反应温度为55℃,最适反应pH为9.5.该结果可为深入发掘DCE01菌株的基因资源提供重要科学依据.
摘要:采用软件 Primer premier 5设计引物,从麻类脱胶高效菌株 DCE01中克隆出一个果胶酶基因 Pel325,重组到表达载体 pET -28a 中,在 E.coli BL21(DE3)中成功表达。试验结果显示,酶的活性随着底物(橘子果胶)酯化程度的增加而增加。胞内酶用酯化程度≥85%的橘子果胶作底物检测时酶活最高(酶活为37.5U /ml),其最适反应温度为55℃,最适反应 pH 为8.0。该结果可为进一步发掘 DCE01菌株的基因资源提供重要科学依据。
[期刊论文] 曾洁
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摘要:地理标志是一种俱乐部物品,是存在于买卖双方的信息传递机制,是生产商基于信誉投资的动态质量决策的结果.地理标志保护能使生产商获得产品经营垄断权,为生产商带来贸易竞争优势.
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