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摘要:纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用.来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBGl)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBGl)在食品以及工业领域中的应用.因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍.突变体的Kcat/Km值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强.当酶活力保留60%以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L.这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率....
[硕士论文] 曹春静
生物工程 山东大学 2018(学位年度)
摘要:白蚁是一种网翅目的社会性昆虫,根据肠道是否存在鞭毛虫可以分为高等白蚁(无鞭毛虫)和低等白蚁(有鞭毛虫)。白蚁主要生活于阴暗潮湿的环境中,多以植物(木头、树叶等)以及植物降解物—腐殖质为食。由于其生活环境的复杂性,比较容易受到外来微生物的侵染,所以白蚁在协同进化过程中形成一种独特的免疫防御机制。此外,白蚁具有惊人的消化降解能力以及破坏性,并且具有高效的木质纤维素降解能力,所以白蚁具有丰富的消化酶基因,是发掘新功能基因以及新型水解酶的模式昆虫。
  本文的研究对象黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi),是一种与真菌共生的高等白蚁,广泛分布于我国南方。黄翅大白蚁能够特异性在白蚁巢内培养鸡枞菌并以此为食,因此与体外真菌和肠道微生物共同构成了三者共生体系。由于它比较特殊,实验室前期对其肠道各部分进行转录组测序,发现许多注释为木质纤维素的基因,包括内切葡聚糖酶(MbEG)、β-葡萄糖苷酶(MbBG)、甘露聚糖酶、漆酶等;此外,还有许多高表达的其他基因如β-1,3(4)-葡聚糖酶基因、几丁质酶基因等。其中MbEG、MbBG已成功异源表达,并对酶学性质进行了研究,但是关于白蚁来源的β-1,3(4)-葡聚糖酶和几丁质酶研究较少。为了探究这些基因在黄翅大白蚁中发挥的作用,我们进行了以下研究:
  1.对M.barneyi肠道各个部分的转录组数据进行总结分析,着重寻找一些高表达的功能基因。其中在转录组数据中共发现141个糖苷水解酶基因(GHs),分别属于29个家族,47个糖基转移酶基因(GTs),112个多糖裂解酶基因(PLs),6个糖酯酶基因(CEs),8个起辅助活性酶基因(AAs);206个与几丁质降解合成相关基因,24个固氮酶基因等。并且从中发现一些高表达的几丁质酶基因和β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,为了探究它们在白蚁中的功能,期望发掘新型水解酶,我们对其进行生物信息学分析,并进行了克隆表达以及酶学性质分析。
  2.β-1,3(4)-葡聚糖酶基因的克隆表达与酶学性质分析。对前期M.barneyi转录组数据中被注释为β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(Mbbgl)的序列进行生物信息学分析,并且通过q-PCR和RT-PCR等技术对其优势表达部位分析,确定该基因为M.barneyi自身来源。以M.barneyi前肠唾液腺的cDNA为模板,通过PCR技术扩增得到Mbbgl基因,全长1085bp,其中可读框(ORF)1035bp,编码349个氨基酸和一个终止密码子,有一个24个氨基酸组成的信号肽,预测的分子量大小为40.21kDa,去除信号肽后的分子量为37.65kDa,等电点(pI)为4.78。Blast分析发现该序列与台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus)β-1,3(4)-葡聚糖酶序列同源性最高为83%,其次是内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)为81%。构建原核表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达和纯化。得到重组蛋白Mbbgl,底物特异性分析,其最适底物为昆布多糖。以昆布多糖为底物其最适温度和最适pH分别是50℃和5.5,对其动力学参数测定,其Vmax为21.83U/mg,Km为3.46mM。利用TLC分析Mbbgl作用方式,发现其不仅具有内切酶活性,而且还具有外切酶的活性,可以从非还原端降解昆布寡糖产生单糖,同时还有具有微弱的糖基转移酶的活性。由于其作用方式的新颖性,对其蛋白结构同源建模分析,并通过密码子优化使其能更好的在原核表达系统中表达。
  3.M.barneyi来源几丁质酶基因MbCht的表达。将黄翅大白蚁来源的表达量较高的3个几丁质酶基因尝试在毕赤酵母GS115中进行异源表达。结果显示MbCht基因可以在毕赤酵母中表达,Western blotting可以检测到信号,其中重组蛋白MbCht1有降解胶体几丁质的活性,但是活性较弱,MbCht2和MbCht3没有检测到活性。
  总之,本文首先对黄翅大白蚁转录组数据进行了总结分析,对β-1,3(4)-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因进行了克隆表达,并对重组酶进行了初步的酶学性质分析,利用同源建模分析了Mbbgl的蛋白结构。
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