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[硕士论文] 景艳军
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种应用性很强的工业微生物菌种,鉴于其较好的重金属抗性,可用于贵金属的浸提、环境污染的治理等领域。铁氧还蛋白作为一种广泛存在并参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌新陈代谢过程诸如铁硫簇组装等重要环节的蛋白质,研究其结构和功能对了解嗜酸氧化亚铁硫杆菌的代谢过程、电子传递及重金属抗性具有重要意义。本研究的内容和结果如下:
  (1)从甘肃省兰州市、白银市和陇南市3个典型矿区采集的样品中分离出四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌,一株氧化亚铁钩端螺旋菌。选取生长周期短、菌体富集量大的菌株BYSW1进行后续的研究。首先选取温度、pH值、接种量、能源种类利用单因素实验对其生长条件进行优化。在pH为2,于30℃下接种10%的菌液,BYSW1生长最好,葡萄糖和蛋白胨会明显抑制其生长。
  (2)在NCBI数据库中找出铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ),在BYSW1中扩增出目的片段,连接到pET-32(a),转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α。自BYSW1扩增出的铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ)与数据库汇总的序列一致性分别为83.92%和85.59%,编码的蛋白与数据库中的序列一致性分别为89.47%和85.59%。
  (3)重组的质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。选取温度、时间、IPTG浓度进行单因素实验,优化重组蛋白的表达条件,并用蛋白质印记法进行验证。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。FdⅠ和FdⅡ分别在25℃下加入0.5mM IPTG诱导6h、25℃下加入0.3mM IPTG诱导6 h表达效果最佳。FdⅠ和FdⅡ分别可用100mM咪唑和50mM咪唑自亲和柱中洗脱下来。
  (4)挑取五种重金属(Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+),对其重金属抗性进行研究;对重金属(Cu2+和Cd2+)驯化前后的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的菌体形态和基因组变化、重组蛋白表达差异、宿主菌体的生长情况进行了研究。结果表明:BYSW1具有较强的重金属抗性,分别在0.04mol/L Cd2+、0.04mol/L Cu2+、0.15mol/L Mn2+、0.08mol/L Ni2+和0.08mol/L Zn2+存在时生长良好,但是高浓度(大于0.04mol/L)的Cu2+和Cd2+会明显抑制BYSW1的生长。Cu2+和Cd2+胁迫后,BYSW1的菌体细胞明显变小,且表面粗糙,但基因组仍然能保持完整。不同浓度、不同种类的重金属胁迫前后,铁氧还蛋白的表达存在显著差异,且Cd2+对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的影响比Cu2+显著;不同浓度、不同种类的重金属对于重组蛋白的表达宿主菌体生长影响不同,0.25mM的Cu2+和Cd2+能明显抑制宿主菌体的生长。
摘要:从NCBI数据库中下载了3种铁氧还蛋白(ACK79261.1,ACK79281.1和ACK80954.1)序列,利用网站在线预测结合软件分析,对其基本理化性质、蛋白修饰、保守结构域、亚细胞定位、二级和三级结构预测和蛋白相互作用网络等方面进行分析和预测.所得数据表明,3种蛋白质均为不稳定的亲水性蛋白质,等电点偏酸性,不含信号肽,均在细胞质中发挥作用;蛋白相互作用分析预测ACK79261.1在核酸代谢过程中发挥重要作用,ACK79281.1主要参与了细胞内的2Fe-2S簇的组装,ACK80954.1对于能量和电子传递必不可少.本研究利用生物信息学预测了铁氧还蛋白结构和功能,为后续研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的电子传递过程以及菌株改良、应用推广提供理论上的依据.
摘要:RND (resistance-nodulation-division)家族转运蛋白广泛分布于革兰氏阴性细菌中,具有催化胞内活性物质(胆酸盐,脂肪酸等)和外排金属离子(Cu+,Ag+)的作用.为探究嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A cidithioba-eillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)RND transporter的功能特性,以本实验室分离鉴定的A.ferrooxidans GB2为材料,采用PCR扩增技术克隆了rnd-1基因.运用生物信息学在线分析软件对该基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测.数据表明:该基因cDNA序列全长1 320 bp,编码439个氨基酸,分子式为C21 00H3330N610O604813,相对分子质量为47.204 kD,为亲水性蛋白;无信号肽,富含延伸链和无规则卷曲结构,三维结构预测表明其符合4KKU结构生物学特点;采用最大似然法构建系统发生树发现RND transporter蛋白在嗜酸氧化亚铁硫杆菌与嗜酸氧化硫硫杆菌中亲缘关系比较近;肽链含有10处磷酸化位点,10处糖基化位点,可能参与细胞质中磷酸化反应,从而对重金属胁迫进行感知和表达.本研究推测该基因在微生物抗重金属过程中有重要的作用.
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