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[硕士论文] 易路
生物学;细胞生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:α-淀粉酶广泛的分布在动物、植物和微生物中,是当今工业化生产中不可或缺的酶制剂之一。在前期的工作中,本实验室从海洋宏基因文库中筛选到了一个与已知的α-淀粉酶的序列相似性低于20%的新型α-淀粉酶AmyP(归属新的糖苷水解酶亚家族GH13_37)。其与GH13其他亚家族的α-淀粉酶进行氨基酸序列对比发现AmyP的Domain B区域片段大小(26个氨基酸构成)仅为当前报道的GH13其他亚家族α-淀粉酶的Domain B区域的20%左右,序列太短,无法如常见的α-淀粉酶一样形成典型的Domain B结构,行使的功能与目前报道的功能也可能并不一样。因此,对这个特殊的Domain B区域的研究能够丰富人们对α-淀粉酶Domain B区域功能的认识,同时也对深入了解α-淀粉酶AmyP的催化机制提供新的信息。
  为了探索α-淀粉酶AmyP中DomainB区域的功能,我们首先设计了整段区域缺失突变和26个位点单点突变实验,发现缺失突变后AmyP淀粉酶丧失酶活,表明虽然Domain B区域很短但也是AmyP不可缺失的部分。归纳26个位点单点突变后检测的酶学性质,发现突变体对不同底物的酶学活性都整体下降。进一步检测突变体的酶学动力学常数(Km、kcat),发现突变降低了酶的酶学活性主要是因为突变降低了酶的催化反应速率(kcat值明显下降),但对酶的亲和力影响并不明显(Km值变化并不显著)。
  为了进一步探索酶的催化反应速率下降的原因,首先通过文献分析发现Domain B区域的氨基酸可能是通过影响酶的整体结构从而降低酶的催化反应速率。因此,设计了在野生型AmyP的激发光下检测完全变性的野生型AmyP、Domain B区域缺失突变体、多点同时突变突变体(酶学活性下降幅度大的9个位点)、单点突变突变体(酶学活性下降幅度大的9个位点)的散射光值的荧光光谱实验,发现随着对DomainB区域改变的减少,芳香族残基所处的环境变化就越不明显,酶的整体结构变化也就越不明显。因此,Domain B区域的氨基酸轻微的影响酶的整体结构。
  其次,通过文献分析也发现Domain B区域的氨基酸也可能影响酶的催化微环境(解离)从而降低酶的催化反应速率。因此,设计了检测突变体的最适 pH的实验(酶的电离发变化是通过酶的最适pH的变化展现出来),发现突变体的最适pH与野生型AmyP相比发生不同程度的碱性偏移,这表明突变体的酶活下降与酶的电离发生了变化有关。为了进一步验证DomainB区域的氨基酸变化确实影响了酶的电离,检测了突变体与野生型AmyP的电离常数pKa值,发现与野生型AmyP相比突变体的酸解离常数发生了碱性偏移,碱解离常数未发生明显变化,这表明Domain B区域的氨基酸改变确实影响了α-淀粉酶AmyP的电离,进而影响酶的催化反应速率的下降。
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