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[硕士论文] 施俊伟
预防兽医学 华中农业大学 2015(学位年度)
摘要:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌,是结核病的病原菌,目前世界上约1/3的人口感染结核分枝杆菌,其中5%-10%的感染者将发展成为活动性结核病,全球每年新增结核病患者约880万,死亡约300万。细胞凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,在组织分化、器官发育、机体稳态等生理过程中发挥着重要作用。尽管细胞凋亡是一种正常的生理现象,但是异常的细胞凋亡常引起许多疾病。调节宿主细胞凋亡是结核分枝杆菌致病性的一部分,影响结核分枝杆菌的生存、繁殖、扩散等过程。
  快速准确的检测细胞凋亡是研究凋亡相关机制以及评价凋亡对疾病过程影响的基础。Caspase-3的激活是细胞凋亡的重要标志,常被应用于凋亡检测方法的建立。为了方便快速的检测结核分枝杆菌蛋白对细胞凋亡的影响,本研究将caspase-3的识别序列与萤火虫荧光素酶融合表达构建了一个新型的caspase-3报告质粒,用于细胞凋亡的检测,并筛选了部分结核分枝杆菌编码的蛋白,具体研究内容如下:
  1.Caspase-3报告质粒的构建及验证
  本研究构建了四种caspase-3报告质粒,将四种报告质粒分别转染HeLa细胞,在细胞凋亡阳性刺激物刺激下,四种报告质粒荧光素酶的值明显增加,同时荧光素酶被切割,说明报告质粒构建成功。细胞凋亡发生时,233-DnaE-DEVDG激活超过25倍,其对照的值处于较低水平,而另外三种报告质粒和相应对照的值同时升高。这些结果说明233-DnaE-DEVDG背景值低、敏感性高,更适合应用于检测细胞凋亡。
  2.结核分枝杆菌ESAT-6家族蛋白的筛选
  将结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族真核表达质粒、233-DnaE-DEVDG和TK共转染HeLa细胞,通过双荧光素酶试验检测结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族成员对细胞凋亡的影响。实验发现esxA、esxT和esxL能激活233-DnaE-DEVDG并呈剂量依赖性,esxC不能激活233-DnaE-DEVDG。
  3.筛选结果的验证
  为了验证筛选结果的可靠性,本研究通过经典的细胞凋亡检测方法验证。Caspase-3在细胞凋亡相关通路中处于中心位置,是评价细胞凋亡的核心指标。本研究通过Western Blot检测发现esxA和esxT可以促进caspase-3的活化,阴性对照esxC不能促进caspase-3的活化;细胞凋亡检测试剂盒染色后,通过流式细胞仪检测发现esxA和esxT可以上调凋亡细胞比率。
  4.核因子-κB(NF-κB)参与esxT诱导的细胞凋亡
  NF-κB通路与细胞凋亡密切相关,在一定情况下,NF-κB激活是细胞凋亡所必须的。为探究NF-κB通路是否参与esxT诱导的细胞凋亡,本研究通过双荧光素酶试验检测发现esxT能激活NF-κ3启动子并呈剂量依赖性,用BAY11抑制NF-κB的激活会导致esxT诱导的细胞凋亡水平部分下降,说明NF-κB的激活参与了esxT诱导的细胞凋亡。NF-κB通路主要通过促进其下游的促凋亡基因表达促进细胞凋亡,为进一步寻找esxT通过NF-κB调控了哪些促凋亡基因的表达,本研究通过Real-Time PCR和Western Blot检测发现esxT能在mRNA和蛋白水平上调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的表达。这些结果说明esxT可能通过NF-κB上调其下游的TNF-α和TRAIL促进细胞凋亡。
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