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[硕士论文] 文刚
儿科(小儿外科) 温州医科大学;温州医学院 2009(学位年度)
摘要:目的: 从胚胎20天SD大鼠消化道提取的神经干细胞-肠神经干细胞(Enteric neural stem cells,ENSCs),在体外生长增殖较缓慢,这对进一步研究和应用造成了一定的阻碍。据报道人参皂甙对脑神经干细胞有促进增殖和分化作用,但对肠神经干细胞作用如何未见报告。本研究观察人参皂甙单体Rb1、Rg1对肠神经干细胞培养、增殖和分化的影响,旨在为今后人参皂甙在肠神经干细胞的基础和临床应用方面奠定基础,最终为治疗肠神经元发育异常性疾病提供依据。 方法: 1.采用改良的ENSCs培养液,以反复传代法从胚胎20天SD大鼠提取神经干细胞。 2.进行Nestin、Tuj-1、GFAP和sMA免疫荧光化学染色,以确定分离培养的细胞是否为ENSCs。 3.传代得到的肠神经干细胞分4组进一步培养:分别加入1umol/l Rb1、1umol/l Rg1、1umol/l Rb1+1umol/l Rg1,及空白对照组,比较4组的神经球生长情况。 4.CCK-8法及Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)法测定4组的神经干细胞增殖速度。 5.流式细胞仪检测比较4组神经干细胞Nestin、Tuj-l、GFAP、SMA染色阳性细胞数目及比例。 结果: 1.培养第3-5天,见细胞贴壁生长;第6-7天,贴壁细胞出现神经球样结构;第9-10天,悬浮生长的肠神经球形成。 2.通过我们使用的ENSCs培养液及分离培养方法,培养的细胞阳性表达Nestin,能分化成为表达Tuj-1的神经元和表达GFAP的神经胶质细胞以及表达SMA的平滑肌细胞,确认为ENSCs。 3.CCK-8测定4组肠神经干细胞增殖速度, Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要快于空白对照组(P<0.05),三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 4.Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)测定4组肠神经干细胞增殖速度, Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要快于空白对照组(P<0.05),而三组间亦无明显统计学差异(P>0.05)。 5.流式细胞仪分别测定Rb1组、Rg1组、Rb1+Rg1组及空白对照组4组肠神经干细胞Nestin阳性细胞比例分别为7.11%、6.53%、6.87%和9.79%;Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要小于空白对照组(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 6.流式细胞仪测定4组肠神经干细胞Tuj-1阳性细胞比例分别为6.48%、8.40%、6.89%和5.20%;Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要大于空白对照组(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 7.流式细胞仪测定4组肠神经干细胞GFAP阳性细胞比例分别为15.59%、14.33%、14.90和10.07%; Rb1组、Rg1组及Rb1+Rg1组,要大于空白对照组(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。 8.流式细胞仪测定4组肠神经干细胞SMA阳性细胞比例分别为3.76%、5.67%、4.07和3.21%;四组间比较Rg1组阳性细胞比例大于其余三组(P<0.05)。 结论: 1.通过我们使用的ENSCs培养液及分离培养方法,能够培养出肠神经干细胞。 2.培养的细胞阳性表达Nestin,能分化为表达Tuj-1的神经元、表达GFAP的神经胶质细胞和表达SMA阳性的的平滑肌细胞,确认为肠神经干细胞。 3.人参皂甙单体Rb1、Rg1能增强体外培养肠神经干细胞的增殖能力,两者促进增殖能力无明显差别。 4.与正常对照组比较,人参皂甙单体Rb1、Rg1能促进ENSCs体外培养向神经元和神经胶质细胞分化(P<0.05),两者促进分化能力无明显差别。 5.与正常对照组比较,人参皂甙单体Rg1能促进ENSCs体外培养向平滑肌细胞分化(P<0.05)。
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