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[硕士论文] 徐玉超
设施农业 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)是我国重要的海洋经济物种,现人工养殖发展迅速,但随之出现性早熟、个体偏小等现象,严重影响其养殖效益。因此研究乌贼生长及生殖发育调控机制是解决这一问题的关键。神经肽Y受体(NeuropeptideY receptor,NPYR)是典型的G蛋白偶联受体,在许多动物的摄食生长和发育繁殖中扮演着重要角色。本论文采用分子生物学、细胞生物学等实验方法,分析曼氏无针乌贼神经肽Y-like(Sepiella japonica NPYR-like,SjNPYR-like)基因的序列特征、受体类型、亚细胞定位、组织分布特征、在摄食中的调控功能及在生长周期中的变动规律。主要取得的研究结果如下:
  采用RACE克隆技术获得了SjNPYR-like的全长序列,并对其序列特征进行了分析,结果表明,SjNPYR-like cDNA序列(KX683395)全长1,902 bp,包含492 bp的5'UTR、228 bp的3'UTR和1,182 bp的ORF,可编码393个氨基酸。与其他G蛋白偶联受体结构类似,SjNPYR-like拥有七个跨膜结构域TM1(AA36-58)、TM2(AA79-101)、TM3(AA111-133)、 TM4(AA145-167)、 TM5(200-222)、 TM6(AA254-271)和TM7(AA286-308)。利用系统进化树分析发现,SjNPYR-like与脊椎动物中神经肽Y受体(Neuropeptide Y receptor,NPYR)的三支亚型(NPYR-1、NPYR-2和NPYR-5)具有同源性,与无脊椎动物中神经肽F受体(Neuropeptide F receptor,NPFR)聚为一支。经多序列比对发现,其与预测的真鞘NPYR序列同源性高达81%。
  利用细胞生物学研究方法,对SjNPYR-like受体细胞定位进行分析,结果表明,通过构建SjNPYR-EGFP表达载体,转染至HEK293细胞中,用荧光染料DiI染膜、DAPI染核,在激光共聚焦显微镜下观察发现SjNPYR-like定位于细胞膜上,与SjNPYR-like序列中存在七次跨膜结构的预测结果相一致,表明SjNPYR-like是一个膜受体,为下一步功能验证奠定了基础。
  通过荧光定量PCR技术分析了SjNPYR-like mRNA在不同生殖阶段曼氏无针乌贼组织中的表达特征。结果表明,SjNPYR-like基因在曼氏无针乌贼脑、性腺和肝等组织中有较高的表达量,在其他组织中表达量相对较低。SjNPYR-like的表达在曼氏无针乌贼的生长发育周期中存在明显的变化;在卵原细胞阶段、原生质生长阶段和间质生长阶段,SjNPYR-like表达量在卵子发生过程中显著上升(P<0.05),到发育成熟阶段即营养质生长阶段SjNPYR-like表达量则显著下降。SjNPYR-like表达量变化特征研究结果说明其在乌贼生殖发育中可能具有一定的调控功能。
  综上所述,本论文克隆了曼氏无针乌贼NPYR-like基因,并对其亚细胞定位和生理实验做了初步的研究,为进一步研究曼氏无针乌贼神经肽受体信号通路转导机制以及生理功能奠定了基础,并为解决人工养殖条件下曼氏无针乌贼个体小、性早熟等问题提供了一定的理论参考。
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