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摘要:目的 利用肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)为蛋白载体研制b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖与蛋白的结合疫苗,并研究其在幼龄大鼠体内的免疫原性以及对肺炎球菌导致的急性中耳炎(AOM)的免疫保护作用.方法 运用酰胺缩合法将PsaA与Hib荚膜多糖偶联结合制备多糖蛋白结合疫苗.选取30只约3周龄无特定病原体(SPF)雌性SD大鼠,体重88 ~ 102 g,随机分成实验组和对照组,每组15只.对幼龄SD大鼠进行疫苗接种,实验组接种Hib-PsaA疫苗,对照组接种磷酸盐缓冲液(PBS).每2周接种1次,3次接种后检测动物血清相关抗体免疫球蛋白G(IgG)水平.然后对实验组及对照组大鼠分别以肺炎球菌经鼓膜穿刺注入中耳以诱发AOM,观察2组大鼠发生AOM的炎症反应情况.结果 运用酰胺缩合法将PsaA与Hib多糖偶联结合,结合物的洗脱峰明显前移,表明细菌多糖与载体蛋白结合成功.接种该结合疫苗的实验组幼龄大鼠产生的抗PsaA抗体IgG的几何平均滴度(GMT)为11 138,抗Hib抗体IgG的GMT为7 017,而对照组抗PsaA抗体IgG的GMT与抗Hib抗体IgG的GMT分别为729和348.实验组2种抗体IgG均明显高于对照组(P<0.001).肺炎球菌攻击后组织病理学检查发现,实验组大鼠在细菌攻击后第3天和第7天中耳炎症反应明显轻于对照组,显示Hib-PsaA结合疫苗对肺炎球菌诱发的大鼠AOM有免疫保护作用.结论 运用酰胺缩合法可成功将PsaA蛋白与Hib多糖偶联结合,所制备的多糖蛋白结合疫苗在幼龄大鼠体内可诱导分别针对PsaA和Hib多糖的有效免疫应答反应,并且可有效预防肺炎球菌导致的大鼠AOM....
摘要:目的 研究以霍乱毒素B(CTB)作为PsaA蛋白疫苗黏膜佐剂经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用.方法 6~8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组,分别接受PsaA蛋白免疫(PsaA组,15μgPsaA蛋白),PsaA蛋白及CTB免疫(PsaA/CTB组,15μgPsaA/4μgCTB),CTB免疫(CTB组,4μgCTB),经鼻腔途径免疫,相同剂量和方法每周免疫两次,连续三周,末次免疫后两周收集鼻腔灌洗液、中耳灌洗液及支气管肺泡灌洗液检测特异性IgA抗体反应;收集血清,检测特异性IgG、IgG1及IgG2a抗体反应;末次免疫后2周,小鼠经鼓膜注射14型肺炎链球菌,攻毒后5天组织病理学评估中耳炎症程度.结果 PsaA/CTB组鼻腔黏膜免疫获得了较高水平的全面免疫应答:鼻腔、中耳和支气管肺泡灌洗液中特异性IgA抗体水平明显高于PsaA组和CTB组(P<0.05);血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平明显高于PsaA组和CTB组(P<0.05);攻毒后5天PsaA/CTB组中耳炎症细胞数少于PsaA和CTB组(P<0.05).结论 CTB是肺炎链球菌蛋白疫苗PsaA有效的黏膜免疫佐剂,黏膜免疫也是PsaA有效的免疫途径,该免疫策略研究为新一代肺炎链球菌疫苗的设计提供了实验基础....
摘要:目的 探讨白细胞介素17A(IL-17A)在肺炎链球菌急性中耳炎(AOM)黏膜免疫中的作用.方法 6~8周无特定病原体(SPF)级BALB/c小鼠,在感染前24h腹腔注射200 μg IL-17A抗体中和体内的IL-17A,注射相同剂量的Ig2a抗体作为对照组(Ig2a),经鼓膜途径注射肺炎链球菌,感染后第5天取中耳灌洗液,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测IL-17A、CXCL2和CXCL5的水平.取中耳听泡,乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,常规石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色,评估中耳炎的严重程度.新型肺炎链球菌PsaA蛋白疫苗经鼻腔途径免疫小鼠,末次免疫后2周取小鼠的脾脏,制成细胞悬液,PsaA抗原刺激72 h,ELISA检测培养上清液IL-17A的水平;末次免疫后2周经鼓膜途径注射肺炎链球菌,攻毒后5d取中耳灌洗液,ELISA检测IL-17A、CXCL2和CXCL5的水平.中耳攻毒后5d取中耳黏膜,抽提RNA,反转录cDNA,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测IL-6、防御素β2和CXCL2 mRNA的表达水平.结果 在固有免疫中,中和体内的IL-17A,感染肺炎链球菌后,中耳有更严重的炎症反应,且中耳IL-17A、CXCL2和CXCL5分泌减少;在适应性免疫中,新型肺炎链球菌PsaA蛋白疫苗在CTB黏膜佐剂作用下经鼻腔途径免疫后,脾上清液分泌了较高水平的IL-17A,中耳攻毒后中耳黏膜灌洗液中检测到较高水平IL-17A,相关细胞因子CXCL2、CXCL5水平增高,中耳黏膜IL-6、防御素β2、CXCL2 mRNA表达量明显增高.结论 IL-17A在肺炎链球菌AOM黏膜免疫中起重要的保护作用,为AOM的治疗和新一代疫苗的设计及免疫策略的选择提供了实验依据....
摘要:目的:研究以肺炎球菌表面黏附素(PsaA)为蛋白载体的 b 型流感嗜血杆菌(Hib)多糖结合疫苗的制备及其免疫原性和免疫保护作用。方法用基因工程技术制备 PsaA 基因重组蛋白(rPsaA),通过酰胺缩合法与 Hib 多糖偶联结合,制成结合疫苗(Hib-PsaA)。用此疫苗免疫接种3周龄幼鼠,同时以破伤风类毒素和 B 型流感嗜血杆菌(Hib)多糖结合疫苗(Hib-TT)接种小鼠作为对照及磷酸盐缓冲液(PBS)接种作空白对照。末次免疫后2周观察小鼠对 Hib 多糖和 PsaA 蛋白的免疫原性应答;同时以肺炎球菌分别注入免疫后小鼠和未免疫的对照小鼠听泡,分别于攻击后第3天和第7天观察小鼠中耳内细菌清除率和中耳炎症反应情况,观察新型疫苗的免疫保护作用。结果以基因工程技术成功制备并纯化 rPsaA 蛋白,并运用酰胺缩合法与 Hib 多糖偶联结合,结合物的洗脱峰前移,证明偶联成功。接种该结合疫苗的小鼠产生的抗 PsaA 的抗体 IgG 几何平均滴度(GMT)为4525;抗 Hib 抗体 IgG 的 GMT 为1393。在接种 Hib-TT 疫苗的对照组中,小鼠产生的抗 Hib 抗体 GMT 为1493,两种疫苗的抗 Hib 抗体 GMT 差异无统计学意义,但是 Hib-PsaA 结合疫苗显示出对肺炎球菌的免疫应答,优于以破伤风类毒素为载体的结合疫苗。细菌攻击后第3天实验组小鼠中耳细菌清除率明显高于对照组,组织病理学检查实验组小鼠细菌攻击后第3天和第7天中耳炎症反应明显轻于对照组,显示了 Hib-PsaA 结合疫苗针对肺炎球菌的有效免疫保护作用。结论运用基因工程技术可获得高纯度、高产量的 rPsaA 蛋白,以酰胺缩合法可成功将 rPsaA 蛋白与 Hib 多糖偶联结合,所制备的多糖蛋白结合疫苗在幼小鼠体内可诱导针对 rPsaA 蛋白与 Hib 多糖的免疫应答反应,并且可有效预防肺炎球菌导致的急性中耳炎。提示该疫苗免疫可以在预防 Hib 感染性疾病的同时,对肺炎链球菌导致的急性中耳炎可能有一定的预防作用。...
摘要:目的 探讨以壳聚糖包裹的PotD DNA(Chitosan-potD)纳米微粒经鼻黏膜免疫小鼠对肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用.方法 将制备的Chitosan-potD微粒、裸pVAX1-potD重组质粒(裸potD)及pVAX1分别鼻腔免疫小鼠,收集黏膜和血清标本用以检测特异性抗体水平;分离并培养脾淋巴细胞,检测IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;于免疫小鼠鼻腔进行肺炎链球菌攻击,通过菌落计数评估各免疫组对小鼠肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用.结果 Chilosan-potD纳米微粒在小鼠体内诱导产生的抗PotD特异性血清IgG、IgG1、IgG2a、黏膜IgA抗体水平及IL-17A、IL-4、IFN-γ水平与裸potD组及pVAX1组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);菌落计数结果 显示,Chitosan-potD微粒组在鼻咽部定植的肺炎链球菌数量显著减少(P<0.05).结论 壳聚糖包裹PotD DNA微粒对肺炎链球菌鼻咽部定植具有免疫保护作用....
摘要:目的 观察及检测5-氨基酮戊酸(5-ALA)对于人鼻咽癌CNE细胞的光动力作用.方法 通过5-ALA与CNE细胞共培养后荧光检测确定适合的培养时间及药物浓度,从而观察5-ALA光动力治疗(5-ALA-PDT)后细胞的形态变化及坏死、凋亡情况,并且通过MTT检测5-ALA浓度及激光器能量密度与细胞生存率的关系.结果 5-ALA与CNE细胞共培养的适合时间为12 h,最大有效浓度1 mmol/L.5-ALA-PDT后能观察到细胞凋亡,能量密度越大,变化出现越早.并且,光动力后早期细胞主要凋亡,晚期细胞逐渐坏死.当激光能量密度不变时,细胞死亡率随药物浓度增高而增高,但并不呈线性相关;而5-ALA小于1 mmol/L且固定不变时,细胞生存率随能量密度增高而降低,且呈线性相关.结论 5-ALA对CNE细胞有明显的杀伤作用,并且PDT后的细胞生存率与5-ALA浓度及激光的能量密度相关....
摘要:白加强免疫1次,对照组5只小鼠经pVAX1空载体免疫3次后,生理盐水加强免疫1次,分别采集血清测定两组抗PsaA抗体水平.结果 成功克隆出psaA基因并实现其亚克隆;所构建的psaA核酸疫苗序列正确,同时实现了PsaA蛋白的一步亲和纯化;psaA核酸疫苗可在293T真核细胞中成功表达;核酸疫苗初免后蛋白加强组的抗PsaA抗体滴度高于对照组(t=87.518,P<0.05).结论 成功构建出psaA核酸疫苗,采用核酸疫苗初免-蛋白加强免疫策略能增强肺炎链球菌psaA核酸疫苗的免疫原性....
摘要:目的 构建肺炎链球菌自溶素(pneumococcal autolysin,LytA)核酸疫苗,并研究其免疫原性.方法 采用聚合酶链反应方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将该基因插入到pVAX1真核表达载体中,构建表达LytA的重组质粒,制备成超螺旋比例大于90%的核酸疫苗.实验组:BALB/c小鼠5只,对其分3次肌内注射核酸疫苗(100 μg);对照组:BALB/c小鼠5只,肌内注射pVAXI空载体(100μg)3次.分别采集小鼠血清,采用间接酶联免疫吸附方法测定血清LytA特异性抗体水平.结果 扩增出的LytA基因(957 bp)与基因库中LytA的编码序列(957 bp)一致.成功构建了LytA核酸疫苗.实验组小鼠的血清Ly-tA抗体水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功克隆了LytA基因,制备了LytA核酸疫苗,后者可在小鼠体内诱导较强的特异性体液免疫反应....
摘要:肺炎链球菌是肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎和鼻窦炎的主要致病菌.目前针对肺炎链球菌疾病的预防主要是以多糖为基础的23价多糖疫苗和7价多糖蛋白结合疫苗,但因其有血清型的限制,应用有很大的局限性.因此以肺炎链球菌表面毒力因子或蛋白为基础的、无血清型限制的肺炎链球菌蛋白疫苗将成为新型肺炎链球菌疫苗发展的方向,此文综述了肺炎链球菌蛋白疫苗的研究进展....
[期刊论文] 徐江红 陈兵
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北大核心 CSTPCD CSCD
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摘要:中耳炎是耳鼻喉科常见病,多发病,尤其在儿童中发病率更高.在美国就诊的儿科患者中大约有12%是因为中耳炎.大约有75%的儿童在一岁时至少患过一次中耳炎,17%的儿童至少患过三次中耳炎,而中耳炎的发病高峰年龄是在出生后的6到18月之间....
摘要:目的 克隆肺炎链球菌自溶素(LytA)基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化.方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a(+),构建pET32a(+)-LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,亲和层析法纯化目的 蛋白,将获得的蛋白用Western blot 鉴定.结果 扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+)-LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白.结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础....
摘要:目的 应用基因工程技术制备肺炎链球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A.PsaA),并分析其抗原性.方法 根据基因库中报道的psaA基因序列,从肺炎链球菌基因组中扩增出psaA基因,连接到原核表达载体pET28a中,构建出重组质粒pET28a-psaA,转化大肠杆菌BL21(DE3),采用镍柱亲和层析法纯化PsaA蛋白,Western-blot分析其抗原性.结果 克隆出的psaA基因同基因库中报道的psaA基因序列一致.成功构建出重组质粒pET28a-psaA,基因测序证实重组质粒构建正确.成功表达和纯化出PsaA蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示蛋白分子量为37.kDa,最终得到纯度较高的蛋白,主要以可溶性形式存在,Western-blot分析显示在37-kDa处见到目的 蛋白条带.结论 利用基因工程技术可以克隆出psaA基因,并成功表达和纯化出PsaA蛋白,其抗原性良好.(中国眼耳鼻喉科杂志,2009,9:20-22)...
[博士论文] 徐江红
耳鼻咽喉科学 复旦大学 2011(学位年度)
摘要:研究背景:肺炎链球菌是引起脑膜炎、败血症、菌血症性肺炎等侵袭性疾病以及中耳炎、鼻窦炎等非侵袭性疾病最为常见的一种病原体,在全球范围内每年大约有160万人死于肺炎链球菌疾病,其中大部分来自发展中国家。目前,市场上预防肺炎链球菌疾病的疫苗有两类,一类是23价多糖疫苗,另一类是7价和13价多糖蛋白结合疫苗,前者对于2岁以下儿童、免疫缺陷患者和老人保护性弱,后者包含的血清型有限且易引起血清型替换。因此,研制一种无血清型限制的新型肺炎链球菌疫苗势在必行;肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)是存在于所有肺炎链球菌表面高度保守的蛋白,是一种理想的候选抗原;肺炎链球菌在人类主要定植于鼻咽部,通过咽鼓管途径进入中耳引起急性中耳炎,通过呼吸道进入肺部引起肺炎,进而有可能通过血流引起菌血症和脑膜炎,因此局部的黏膜免疫反应对于预防肺炎链球菌感染至关重要;黏膜免疫是一种有效的诱发局部免疫力的策略,然而鼻黏膜表面富含的纤毛、粘液,分泌的蛋白核酸酶以及上皮屏障使得抗原很难吸收,需要合适的黏膜输送系统或佐剂,壳聚糖(chitosan)是一种有效的黏膜输送系统,与蛋白或核酸结合形成纳米颗粒,有利于抗原的吸收。因此,在本项研究中采用chitosan作为PsaA蛋白和核酸的黏膜输送系统。
  目的:研究chitosan包裹PsaA重组蛋白或核酸形成的纳米颗粒经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎、败血症和鼻咽部定植的保护作用。共分三部分:(1)壳聚糖包裹的PsaA重组蛋白纳米颗粒的制备及黏膜免疫诱生特异性免疫应答研究;(2)黏膜免疫chitosan-PsaA纳米颗粒预防急性中耳炎和败血症研究;(3)黏膜免疫壳聚糖包裹的PsaADNA纳米颗粒预防肺炎链球菌鼻咽部定植作用研究。
  方法:(1)chitosan-PsaA纳米颗粒的制备:PCR法从肺炎链球菌基因组扩增PsaA基因,与pET28a构建重组原核表达质粒pET28a-psaA,以其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达PsaA蛋白,亲和层析获得纯化的PsaA蛋白,westernblot鉴定其抗原性;采用离子交联技术制备chitosan-PsaA纳米颗粒,并检测其粒径及电位;(2)鼻腔接种chitosan-PsaA纳米颗粒诱生免疫应答研究:将制备的chitosan-PsaA纳米颗粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分别鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集鼻腔灌洗液(nasalwashes)、中耳灌洗液(MEL)及支气管肺泡灌洗液(BALF)检测特异性IgA抗体反应;收集血清,检测特异性IgG抗体反应;分离并培养脾细胞,检测IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;(3)chitosan-PsaA纳米颗粒预防急性中耳炎研究:以chitosan-PsaA纳米颗粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分别鼻腔免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,小鼠中耳听泡注射14型肺炎链球菌,分别于攻毒后3天和7天进行中耳菌落计数及中耳组织病理学检查,并收集中耳支气管肺泡灌洗液;(4)chitosan-PsaA纳米颗粒预防败血症研究:以chitosan-PsaA纳米颗粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分别免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,腹腔分别注射3型和14型肺炎链球菌,观察小鼠21天内的存活率;(5)黏膜免疫保护机制探讨:检测小鼠免疫血清中特异性抗体的结合功能、抑制黏附功能以及调理吞噬功能;双抗夹心法检测免疫小鼠中耳攻毒前、攻毒后3天和7天支气管肺泡灌洗液中IL-17A水平;(6)黏膜免疫壳聚糖包裹的PsaADNA纳米颗粒预防肺炎链球菌鼻咽部定植作用研究:PCR法从3型肺炎链球菌基因组扩增Psa,A基因,与pVAX1构建真核表达质粒pVAX1-psaA,RT-PCR及Westernblot鉴定pVAX1-psaA在体外真核细胞中的表达;复凝聚法制备chitosan-psaA纳米颗粒,并检测其粒径及电位大小,通过与DnaseⅠ共培养评估chitosan保护DNA免遭降解的能力;用制备好的chitosan-psaA纳米颗粒、pVAX1-psaA(nakedpsaA)、chitosan-pVAX1分别免疫BALB/c小鼠,每两周一次,连续4次,末次免疫后2周,收集鼻腔、中耳及支气管肺泡灌洗液检测特异性IgA抗体反应;收集血清检测特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体反应;分离并培养脾淋巴细胞,检测IL-17A及工FN-γ的分泌水平;鼻腔滴入3型肺炎链球菌,5天后通过菌落计数评估各免疫组对肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用;收集鼻腔攻毒前及攻毒5天后的支气管肺泡灌洗液,通过双抗夹心法检测IL-17A水平。
  结果:(1)从肺炎链球菌基因组成功扩增PsaA编码序列,经测序鉴定与GenBank中序列一致,成功构建pET28a-psaA原核表达质粒,并利用原核表达系统获得了可溶性的PsaA蛋白,经Westernblot证实PsaA蛋白具备抗原性;成功制备了大小平均为691nm、表面电位为+21.1mV的chitosan-PsaA纳米颗粒;(2)chitosan-PsaA组鼻腔黏膜免疫获得了较高水平的全面免疫应答:鼻腔、中耳和支气管肺泡灌洗液中特异性IgA抗体水平明显高于nPsaA和chitosan组(P<0.05);血清中特异性IgG抗体水平明显高于nPsaA和chitosan组(P<0.05);经PsaA抗原刺激后脾细胞分泌的IL-17A、IL-4及IFN-γ水平明显高于nPsaA和chirosan组(p<0.05);(3)评估chitosan-PsaA纳米颗粒对急性中耳炎的保护作用结果表明,攻毒后3天chitosan-PsaA纳米颗粒组中耳的菌落计数明显少于nPsaA和chitosan组(P<0.05),而攻毒后7天chitoan-PsaA组小鼠均无细菌定植,与chitosan组相比明显减少(P<0.05),nPsaA组4只小鼠有细菌定植,chitosgtn组6只小鼠有细菌定植;攻毒后3天和7天chitoan-PsaA组鼓膜的厚度和中耳炎症细胞数均少于nPsaA和chitosan组(P<0.05);(4)评估chitosan-PsaA纳米颗粒预防败血症的研究结果表明,chitosan-PsaA组3型14型肺炎链球菌小鼠的存活率均为100%,与nPsaA和chitosan组相比差异具有统计学意义(P<0.05),证实了该PsaA疫苗具有交叉保护性;(5)抗体功能实验表明chitosan-PsaA组小鼠的血清抗体有较高的抗体结合功能、抑制黏附功能和调理吞噬功能,参与了黏膜保护机制;黏膜局部IL-17A水平在小鼠中耳攻毒3天开始升高,7天明显升高,chitosan-PsaA组与nPsaA和chitosan组相比有明显更高水平的IL-17A(P<0.05);(6)成功构建了pVAX1-psaA真核表达载体,经RT-PCR和Westernblot鉴定该质粒可以在体外培养的真核细胞中表达;制备了平均大小为392nm、表面电位为+12.5mY的chitosan-psaA纳米颗粒,该纳米颗粒具有保护pVAX1-psaA免遭DnaseⅠ降解作用;chitosan-psaA免疫组在小鼠体内诱导产生的血清中PsaA特异性IgG、IgG1、IgG2a、粘膜IgA抗体水平及IL-17A、IFN-γ水平与裸psaA组及chitosan-pVAX1组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);chitosan-psaA组较裸psaA组及chitosan-pVAX1组小鼠肺炎链球菌鼻咽部的定植量明显降低(P<0.05);鼻腔攻毒前黏膜IL-17A水平较低,攻毒后IL-17A水平升高,chitosan-psaA免疫组明显高于裸psaA组及chitosan-pVAX1组(P<0.05),提示IL-17A可能参与了局部黏膜免疫,有利于肺炎链球菌从鼻咽部的清除。
  结论:chitosan不论包裹PsaA蛋白疫苗还是核酸疫苗均能形成纳米颗粒,该纳米颗粒能够诱导实验动物特异性体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答,并对肺炎链球菌导致的急性中耳炎、败血症和鼻咽部的细菌定植具有保护作用;本研究获得的chitosan-PsaA和chitosan-psaA纳米颗粒是一种有效的黏膜免疫疫苗,以其黏膜免疫可望应用于肺炎链球菌感染的防治研究,该免疫策略研究为新一代肺炎链球菌疫苗的设计提供了实验基础。
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