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摘要:目的 研究下调B7-H3分子的表达对人肝癌(HCC)细胞生物学特性的影响,探讨B7-H3表达对HCC组织发生发展的临床意义.方法 选择两株B7-H3表达水平较高的HCC细胞,通过RNA干扰技术下调HCC细胞B7-H3的表达,采用CCK-8、流式细胞术、细胞划痕和Transwell小室等技术,观察HCC细胞在增殖、凋亡、迁移及侵袭等方面的改变;制备不同复发时间(1年内复发和超过1年复发)的HCC组织芯片,采用免疫组织化学法检测B7-H3在80例HCC组织及癌旁肝组织中的表达,进一步分析B7-H3的表达与HCC复发转移及其他临床病理参数的关系.结果 选择B7-H3表达水平较高的HCC细胞株SK-hep-1和M HCC97L,转染B7-H3 siRNA后构建B7-H3下调的细胞模型,发现下调B7-H3蛋白后,HCC细胞的侵袭和迁移能力显著下降(P<0.05),而增殖和凋亡能力未见明显影响;B7-H3在肝癌组织中的阳性率(73.33%)高于癌旁肝组织(54.67%)(P=0.041);B7-H3阳性表达率与HCC分化程度(P=0.012)、复发时间(P=0.001)、转移情况(P=0.007)呈正相关,而与年龄、性别、肿块大小、甲胎蛋白(AFP)等临床病理特征无明显相关.结论 B7-H3可作为HCC复发与转移的潜在指标,下调B7-H3表达可为抑制HCC侵袭提供新思路....
[硕士论文] 张香西
病理学与病理生理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,占肝癌的90%,有数据表明:HCC由于其发病率逐年增加且预后差现位居世界恶性肿瘤致死病因的第2位。
  GPC-3是过度生长综合症(Simpson Golabi BehmelSyndrome,SGBS)患者中普遍存在的功能突变基因,是蛋白聚糖家族成员之一。GPC-3基因编码的GPC-3蛋白可通过共受体(co-receptor)与相关配基如生长因子、细胞黏附分子等共同作用,来参与细胞生物学行为的调节。有学者认为在细胞生长的各个过程包括细胞的繁殖、黏附、分化、迁移等过程中均存在GPC-3的直接或间接调控。研究发现HCC患者体内的GPC-3表达水平跟健康人及良性肝疾病患者相比显著升高,正常成人及良性肝疾病患者组织和血清中的GPC-3表达水平极低甚至检测不到,这表明GPC-3与HCC关系密切,可能在其发生发展中起促进作用。
  GPC-3是HCC临床鉴别诊断中有用的特异性标志物,又是HCC预防和免疫治疗的新靶点,尽管目前有多篇文章探讨其分子机制,它的结构已基本研究清楚,但是其功能尚未完全阐明。基于以上研究背景,本课题通过Crispr/cas9技术对GPC-3进行敲除并构建了GPC-3过表达载体,沉默和上调HCC细胞中GPC-3基因的表达,进而研究GPC-3对于肝癌的生长、侵袭等生物学行为的影响,为进一步阐明GPC-3在HCC中的作用机制,指导HCC的临床治疗奠定基础。
  方法:
  1、通过Western-blot和Q-PCR检测多株HCC细胞中GPC-3蛋白/基因的表达水平,选择GPC-3高表达和低表达的HCC细胞株;
  2、按照Genebank(NCBI)中GPC-3基因序列设计引物,PCR扩增、纯化以获取GPC-3目的片段,经基因重组及双酶切来构建GPC-3过表达载体;
  3、运用Crispr/cas9技术设计三条靶向GPC-3基因的gRNA,插入Crispr/cas9敲除载体后导入高表达GPC-3的细胞株,筛选出一条编辑效率最高的gRNA;
  4、将上述GPC-3过表达载体及GPC-3敲除载体用第三代慢病毒包装系统分别进行慢病毒载体包装,浓缩细胞上清液后获得相应的病毒液;
  5、用上述含有GPC-3过表达载体的慢病毒液感染低表达GPC-3的HCC细胞,用含有GPC-3敲除载体的慢病毒液感染高表达GPC-3的HCC细胞,通过嘌呤霉素(puro)持续药筛获得GPC-3过表达稳定细胞株以及不表达GPC-3的单克隆细胞株,用Western-blot和Q-PCR技术检测细胞中GPC-3的表达情况;
  6、通过CCK-8、划痕实验、Transwell及流式细胞仪分别检测细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡情况,观察GPC-3过表达/敲除后细胞的生物学行为的改变趋势;
  7、观察敲除GPC-3后Huh-7细胞的裸鼠皮下移植瘤模型的生长情况,判断GPC-3敲除细胞株的体内成瘤能力。
  结果:
  1、多株HCC细胞中GPC-3基因表达水平从高到低的顺序为:HepG2>Hep3B>Huh-7>LM3>MHCC97H>MHCC97L,SK-hep-1几乎不表达GPC-3;
  2、Western-blot检测HCC细胞的GPC-3蛋白表达水平,HepG2、Hep3B、Huh-7三株细胞高表达GPC-3,LM3、MHCC97H、MHCC97L、SK-hep-1四株细胞未检测到明显GPC-3条带;
  3、成功构建GPC-3过表达慢病毒载体,获得三个GPC-3完全敲除的病毒载体;
  4、选择MHCC97L、SK-hep-1两株细胞用于过表达GPC-3,Huh-7细胞用于敲除GPC-3,获得GPC-3过表达的稳转细胞株及敲除的单克隆细胞株。通过Western-blot和Q-PCR证实各株细胞成功过表达/敲除GPC-3;
  5、过表达GPC-3后,SK-hep-1细胞的增殖能力被抑制,而MHCC97L细胞的增殖能力不受影响,敲除GPC-3后,Huh-7细胞的增殖能力明显降低;
  6、过表达GPC-3后,与对照组相比,MHCC97L、SK-hep-1细胞的迁移/侵袭能力均增强,而敲除GPC-3的Huh-7细胞的迁移及侵袭能力明显低于对照组;
  7、过表达/敲除GPC-3后,MHCC97L、SK-hep-1、Huh-7三株细胞的凋亡情况与对照组相比均没有明显差异;
  8、裸鼠成瘤实验发现敲除GPC-3组Huh-7细胞在裸鼠体内成瘤能力低于对照组。
  结论:
  成功构建GPC-3过表达/敲除载体,并获得稳定过表达/敲除GPC-3的HCC细胞株。通过体内外实验发现GPC-3能促进HCC细胞的迁移、侵袭,但对HCC细胞体外增殖的影响因细胞系的不同而不同,GPC-3与肝癌细胞的凋亡无密切相关。以上结果提示通过抑制HCC患者体内GPC-3的表达可作为治疗HCC的有效手段。
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