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摘要:为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hrGFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白.以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪IgA-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性IgA抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验.特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%.利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%.本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性IgA抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段....
摘要:为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性分泌性IgA (PEDV SIgA)抗体,本研究以纯化的PEDV粒子作为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子处理样品为检测样品,以HRP标记的鼠抗猪SIgA分泌成分(SC)的单克隆抗体(MAb)为酶标二抗,经过各条件优化,建立了检测初乳和直肠黏膜中PEDV SIgA的间接ELISA方法.并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验.结果 显示,PEDV粒子的最佳包被浓度为5.8 ng/孔,HRP标记的鼠抗猪SC抗体的最佳稀释度为1∶3 000.该方法与TGEV、PoRV感染的初乳样品无交叉反应,特异性较强.当初乳的稀释度在1∶6 400时,该ELISA方法检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好.该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIgA水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,具有很好的应用前景....
摘要:阐述了果园绿肥在减少水土流失、改善土壤理化性状、平衡土壤温度、提高微生物种群数量和土壤酶活性、抑制杂草生长、增加害虫天敌数量等改善果园生态环境、促进果树生长、提高果品产量和品质、增加果农收入、保持山西果业可持续发展等方面的重要作用,针对山西省果园土壤管理中长期清耕造成水土流失严重、土壤肥力下降、果园生态环境恶化、影响果品质量等问题,提出了在果园土壤管理上大力发展果园绿肥的倡议及选择果园绿肥的原则....
摘要:为获得抗猪分泌型IgA (SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9.MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链.杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000.Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白.抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景....
摘要:为阐明细胞核仁蛋白NPM1与猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N蛋白)共定位的关键位点.本实验通过设计突变引物,利用重叠延伸PCR方法对NPM1氨基酸位点T199、K230和K263进行定点突变,分别将其克隆至真核表达载体pDsRed2-N1中,获得重组质粒pDsRed2-NPM1 (T199A)、pDsRed2-NPM1 (K230R)、pDsRed2-NPM1 (K263R).随后分别将pDsRed2-NPM1 (WT)、pDsRed2-NPM1 (T199A)、pDsRed2-NPM1 (K230R)、pDsRed2-NPM1 (K263R)与重组质粒pAcGFP-N共转染Vero E6细胞.共聚焦结果显示NPM1 (T199A)、NPM1(K230R)、野生型NPM1均与N蛋白共定位于细胞的核仁中.虽然NPM1 (K263R)与N蛋白具有共定位现象,但两者共定位于细胞核中.该实验结果为进一步研究核仁蛋白NPM1参与PEDV复制的分子机制奠定了基础....
摘要:为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白1(NSP1)在Vero E6细胞中的分布和亚细胞定位情况,本研究采用RT-PCR方法扩增NSP1基因,并将其克隆至真核表达载体pAcGFP-C1中构建重组质粒pAcGFP-NSP1.将pAcGFP-NSP1转染至Vero E6细胞中进行瞬时表达,并收集转染后48 h的细胞进行western blot检测.通过激光共聚焦显微镜观察NSP1在细胞中的定位情况.结果表明,NSP1在Vero E6细胞中表达,其主要定位于细胞质中,与细胞中的线粒体、内质网、高尔基体均呈现高度共定位.本研究在Vero E6细胞中表达了PEDVNSP1蛋白,并首次对其亚细胞定位进行了解析,为进一步了解病毒的复制及其致病机制的研究提供了依据....
摘要:采用大田试验,研究花期喷施15.0,30.0,45.0,60.0 g/hm2缩节胺对毛叶苕子主茎长度、收获期秸秆与籽粒产量的影响.结果表明,花期喷施缩节胺可有效抑制毛叶苕子主茎的伸长,降低毛叶苕子的秸秆产量,提高毛叶苕子的籽粒产量;随着缩节胺喷施量的增大和喷施次数的增加,缩节胺抑制毛叶苕子主茎伸长的效果、降低毛叶苕子秸秆产量和提高籽粒产量的效果显著增强,其中,以初花期连续3次喷施60.0 g/hm2缩节胺处理对抑制毛叶苕子主茎长度的效果最好,连续3次喷施45.0 g/hm2缩节胺处理的毛叶苕子籽粒产量最高....
摘要:猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似.相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体.为研究pAPN是否是PDCoV入侵宿主细胞的受体,本研究以TGEV为指示病毒,通过BHK-pAPN细胞感染试验、pAPNRNA干扰试验、ST细胞过表达pAPN试验、可溶性pAPN阻断试验,发现BHK-pAPN细胞是PDCoV非易感细胞,在易感细胞ST上沉默和过表达pAPN对PDCoV的增殖并无影响,可溶性pAPN不能阻止PDCoV感染ST细胞.这些研究结果表明pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,而且对PDCoV的增殖无影响....
摘要:[目的]烤烟感官质量是衡量烟叶质量的重要因素,淀粉是烟叶生产加工过程中含量变幅较大的成分.本文研究了烤烟烟叶淀粉含量与感官质量之间的关系.[方法]取200份福建烟区云烟87(C3F等级)初烤烟叶作为试验材料,先用聚类分析方法对样品进行分类,再运用灰色关联度分析、简单相关分析研究烤烟烟叶淀粉含量与感官质量两者之间的关系.[结果]淀粉主要影响刺激性与余味,对其他指标影响不明显.淀粉含量在4.65%以下时,对感官质量基本无影响;当淀粉含量在4.65%~7.60%,随着淀粉含量的升高刺激性有增加趋势,余味变差;当淀粉含量大于7.60%时,刺激性显著增加,余味明显变劣;淀粉含量还一定程度上影响烟叶杂气种类与香型风格.[结论]研究揭示了烟叶淀粉含量与感官质量之间的关系,对降低烟叶淀粉含量、改良生产工艺具有指导意义....
摘要:为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的原位检测方法,本研究以TGEVN蛋白的单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠IgG-HRP为二抗,AEC过氧化物酶底物为显色液,建立了TGEV的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测方法.检测结果显示,一抗的最佳使用浓度为0.5 ng/μL,二抗的最佳稀释倍数为1∶2 000倍,经AEC显色,TGEV感染的阳性细胞呈红棕色;对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好特异性;同时该方法能够在普通显微镜下观察到病毒在细胞中的分布情况.本研究建立的方法为TGEV的实验室鉴定及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供有效的检测手段....
摘要:为了筛选与猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库.采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库.结果显示,文库滴度为8.1×108 CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%.此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础....
摘要:为明确毛叶苕子(Vicia villosa Roth.)繁种田根茬还田提供土壤氮的能力,以无根茬田为对照,以坝莜1号燕麦为供试作物,比较了毛叶苕子繁种前后0 ~20cm土壤养分状况,在山西省右玉县开展了毛叶苕子茬口不同施氮量农田试验研究.结果表明,毛叶苕子繁种后,0~20 cm土壤有机质、全氮、碱解氮分别比繁种前提高了0.09,0.002 g/ks和3.6 mg/kg;无根茬田施用100%N与毛叶苕子茬口施用90%N的燕麦产量无差异,毛叶苕子繁种田根茬还田的供氮能力相当于6.90 kg/hm2的化肥氮;毛叶苕子茬口不同施氮量比无根茬施用100%N的氮肥偏生产力提高了1.95~6.67 kg/kg.研究结果可为开展晋西北丘陵区毛叶苕子繁种、提高后作杂粮产量提供理论依据....
摘要:为了研究福建烟区中部烟叶硫含量对烟叶质量的影响,通过选取中部烟叶样品758份,对烟叶样品进行外观质量评价、常规化学成分测定并挑选部分样品进行烟叶物理特性检测、感官质量评价.结果表明:福建烟区中部烟叶硫含量与烟叶外观质量中身份、油分呈显著负相关;与烟叶常规化学成分中烟碱含量呈极显著正相关,与钾含量呈显著正相关;与烟叶物理特性中厚度呈极显著负相关;与感官评吸质量指标中香气质、杂气、刺激性得分呈显著负相关.最终确定了福建烟区烟叶硫含量适宜区间为0.41%~0.70%....
摘要:猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现.2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV.目前,只有美国成功分离到2株PDCoV.为分离鉴定PDCoV,本研究将PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾细胞(LLC-PK)并连续传代培养.通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光和基因序列测定对细胞培养物进行鉴定.结果表明我们成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株.M基因的系统发育分析表明NH株与中国、美国及韩国的PDCoV亲源关系较近.本研究为进一步研究PDCoV的致病性和致病机制奠定了基础....
摘要:为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞产生病变及细胞凋亡的动态变化,本研究应用western blot、间接免疫荧光、细胞活性计数(CCK-8)等方法检测PEDV感染Vero E6细胞后不同时间点细胞内病毒含量、细胞活性、凋亡小体的形成,以及相关凋亡因子的变化.结果表明,感染后24 h细胞内病毒含量开始明显升高,48 h时达到峰值.同时在病毒感染24 h后出现明显的细胞病变,感染48 h后出现典型的凋亡特征,细胞聚堆,细胞核内染色质固缩,形成凋亡小体.CCK-8分析检测结果显示,与对照组相比感染病毒细胞活性明显降低.另外,western blot结果表明促凋亡因子蛋白水解酶Caspase-3在病毒感染过程中被活化.该研究结果进一步证实了PEDV感染可以诱导细胞凋亡,其中Caspase-3的激活在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用....
摘要:为建立灵敏、特异的G9型猪轮状病毒(PoRV) TaqMan的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的G9型PoRV NMTL株的VP7基因保守区域设计一条特异性引物和探针.以104 TCID50的病毒液所提取的总RNA进行10倍系列稀释作为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了检测G9型PoRV的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.结果显示,该方法的相关系数R2=0.991,对其它常见的PoRV(G5)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法最低可以检测到的病毒滴度为10-3 TCID50,比普通RT-PCR方法灵敏度高约1 000倍;组内和组间变异系数均小于0.87%,稳定性高,重复性好.对疑似感染PoRV的45份临床病料样品进行检测,结果表明,该方法阳性率(64.4%)高于普通RT-PCR (44.4%),两者总符合率为80%.本研究建立的方法为PoRV的流行病学调查和早期诊断奠定基础....
[期刊论文] 张鑫 时洪艳 徐佳
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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:为鉴定猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)与宿主细胞核仁素(NCL)蛋白的相互作用,本研究将重组质粒pEGFP-CSFV-C转染至猪睾丸细胞(ST)中,采用GST pull-down和免疫共沉淀方法沉淀ST细胞中的NCL蛋白,通过共聚焦显微镜分析C蛋白和NCL蛋白的共定位情况.结果表明,CSFV C蛋白与NCL蛋白在核仁中存在共定位现象,并且在体外和转染细胞中均存在相互作用.NCL蛋白被抑制后,CSFV的复制能力下降.本研究为进一步分析C蛋白核转运机制以及在CSFV复制过程中的功能提供了实验依据....
摘要:为制备A组猪轮状病毒(PoRV)非结构蛋白NSP3的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究将原核表达、纯化的重组NSP3蛋白(rNSP3)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA法筛选,得到一株能够稳定分泌抗PoRV (G9)的杂交瘤细胞株(5B8).MAb鉴定结果显示其抗体亚类为IgG1型;MAb细胞培养上清液效价为1:103,western blot及间接免疫荧光结果表明该株MAb能够与PoRV反应.对NSP3蛋白进行截短表达,采用western blot试验确定所获得的MAb识别的抗原表位区域序列为290QDYDRTFL297.该MAb的制备为进一步研究NSP3蛋白的结构和功能奠定了良好的基础....
[期刊论文] 张鑫 刘宁 时洪艳 徐佳
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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:为鉴定猪瘟病-毒-(CSFV)衣壳蛋白(C)在细胞中的核仁定位信号(NoLS),本研究采用截短表达的方法将含有C基因不同片段的真核表达重组质粒转染猪睾丸细胞(ST).结果表明,瞬时表达的截短C蛋白的aa51-aa71多肽定位于ST细胞核仁中.而将C蛋白的aa51-aa71缺失突变后,C蛋白则丧失了其核仁定位的能力.此外,将C蛋白的51KKK53突变为51AAA53,也同样导致C蛋白丧失核仁定位能力,表明该序列为核仁定位的核心基序.本研究为进一步分析C蛋白在CSFV复制过程中的功能提供了实验依据....
摘要:为制备猪传染性胃肠炎病-毒(TGEV)NSP5蛋白的单抗隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达并纯化的重组NSP5蛋白(rNSP5-GST)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接EHSA方法筛出一株稳定分泌抗TGEV NSP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(5c3).MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为IgG1/κ链.杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1:6 400和1:105.Western blot鉴定表明该MAb能够识别原核及真核表达的NSP5重组蛋白.利用肽扫描法鉴定显示,该MAb识别的抗原表位为286EFTPTEVIRQMYGVN300.本研究制备的MAb及其抗原表位的鉴定,为TGEV NSP5蛋白结构和功能的研究奠定了基础....
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