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摘要:目的 制备牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行初步鉴定.方法 构建含PEPCK基因的重组质粒,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达,对表达产物PEPCK重组蛋白进行纯化,以PEPCK重组蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞,用间接ELISA筛选阳性克隆,获得稳定分泌抗牛PEPCK mAb的细胞株,并用Western blot法,免疫组织化学染色和免疫沉淀鉴定其特异性.结果 成功获得稳定分泌抗牛PEPCK mAb的杂交瘤细胞株.Western blot法、免疫组织化学和免疫沉淀结果表明,该抗体能与牛PEPCK蛋白特异性结合.结论 成功获得抗牛PEPCKmAb.
[博士论文] 张纬
病理与病理生理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分应用CRISPR/Cas9技术构建C3基因敲除猪模型
  研究背景:
  补体系统是免疫系统中重要的组成部分,它包含了30多种可溶性蛋白和膜蛋白,其活化过程为一系列的级联酶解反应。补体系统参与机体的特异性和非特异性免疫机制,主要生理作用为:溶解细胞、细菌和病毒的细胞毒作用;调理作用;引起炎症反应;清除免疫复合物和凋亡细胞。它主要包含了三条途径:经典途径、旁路激活途径和甘露糖结合凝集素途径。补体蛋白C3是三条途径的交汇点,它主要由肝脏细胞合成,除此之外,还由巨噬细胞、树突细胞、白细胞、近端肾小管上皮细胞、成纤维细胞、子宫上皮细胞、肺细胞和激活的T细胞等合成,表明C3在机体中发挥着重要的作用。据文献报道,C3与很多疾病相关,如肾小球疾病、溶血性尿毒综合症、胃癌以及风湿性关节炎等。目前为止,C3基因缺失的小鼠、豚鼠等啮齿类动物模型已有报道,但是这些动物模型由于它们的生理学和表观遗传学与人类有很大差异而受限制,大动物C3基因缺失模型却没有报道过。而猪在解剖结构及生理、免疫特性上与人类比较相近,且用猪作为动物模型不存在伦理上的障碍。
  最近,CRISPR/Cas9基因编辑技术大大提高了基因编辑效率,并且广泛应用于小鼠、兔子、山羊和猪等动物身上。在本实验中,我们运用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术构建C3基因敲除猪模型。
  研究目的:
  构建C3基因敲除、补体缺失的免疫缺陷猪模型。
  研究方法:
  1.从基因库里找到猪的C3基因,根据CRISPR/Cas9的构建原则,在第26个外显子上设计两个CRISPR/Cas9打靶位点,然后进行质粒构建。选择一个效率高的质粒进行核转染,筛选单克隆细胞,并进行测序鉴定。
  2.用双等位基因敲除的C3单克隆细胞作为体细胞核移植的供体,以去核的卵母细胞作为受体,借助体细胞核移植的方法获得重构囊胚,在体外培养至桑椹胚期移植到同期发情的代孕母猪子宫内,最终获得C3基因敲除小猪。
  3.将获得的新生克隆小猪的耳部组织提取基因组进行靶点位置PCR扩增,然后用PCR产物连接T载体送测序的方式进行基因型鉴定;采用Western Blot、ELISA和免疫组织化学的方法检测C3蛋白表达情况;用脂质体免疫测定法检测血清中补体活性(CH50);用补体依赖性的毒性试验方法检测C3敲除小猪血清对人293T细胞的杀伤力。
  实验结果:
  1.根据猪的C3基因序列,设计并构建2个CRISPR/Cas9打靶质粒,然后进行转染猪原代成纤维细胞,最终得到C3双等位基因敲除的细胞系。借助体细胞核移植技术,进行两批克隆实验。第一批共移植受体猪6头,怀孕1头且自然生产6头新生小猪。第二批移植受体猪共3头,其中怀孕2头,一头自然生产10头新生猪仔,取耳部组织培养原代成纤维细胞;另外一头自然分娩出3头新生猪仔,两批克隆总共生产了19头克隆小猪。
  2.两批克隆出生的小猪基因型鉴定结果均为C3基因靶点位置双等位基因敲突变,且都与相应的供体细胞基因型相对应;Western Blot和ELISA试验结果显示,克隆小猪的血清中几乎没有C3蛋白的表达;免疫组织化学的试验结果显示,C3敲除小猪的肝脏、脾脏、肾脏和肺组织等均没有C3蛋白的表达;通过检测血清中CH50的值,结果显示克隆小猪体内没有检测出补体活性;补体依赖性细胞毒性试验结果表明,C3敲除小猪的血清对人293T细胞没有杀伤作用,相反,野生型小猪血清对人的293T细胞有很大的杀伤作用。
  结论:
  利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,结合体细胞核移植(SCNT)技术可以成功获得健康的C3双等位基因敲除、补体系统缺失的免疫缺陷猪模型。我们是世界首例C3基因敲除猪模型。我们的结果不仅再次证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效构建猪的基因缺陷模型,而且还为进一步研究补体系统在人机体的作用打下了基础。
  第二部分稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
  研究背景:
  人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)是具有自我更新和多向分化潜能的多能性干细胞,它可在体外诱导分化形成多种细胞和组织。1998年,人胚胎干细胞的建立、研究和应用是干细胞研究领域的一项革命性进展。遗传修饰揭示了hESCs重要的生物学特性,对hESCs自我复制、定向分化、体内动态追踪具有重要的作用。但由于hESCs培养困难,缺乏有效的转染方法,外源基因表达困难等,制约了hESCs的遗传修饰研究。
  Nucleo fector技术直接将DNA转染到细胞核内,大大提高了转染效率。早在2005年,有人利用该技术转染hESCs效率高达20%-65%。转染细胞时因启动子的敏感性,转染后药物筛选过程中易使基因沉默,Jennifer等使用EF1a启动子驱动胚胎干细胞表达红色荧光蛋白,成功获得了能够稳定表达红色荧光蛋白连续传10代的胚胎干细胞。
  胚胎干细胞被分为原始态多能性(na(i)ve)和始发态多能性(primed),来源于小鼠内细胞团(inner cell mass,ICM)的干细胞被认为是na(i)ve状态,来源于上胚层的干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs)被认为是primed状态。研究发现,人胚胎干细胞与上胚层干细胞比较相似,因此也被认为是primed状态。始发态多能性是一种更易进行分化的状态,它不具有发育的全能性。胚胎干细胞的研究可以使人们更好的理解胚胎发育过程及其分子机制,更重要的是胚胎干细胞的临床应用将成为器官再生、基因治疗等的有效工具。
  基于以上的研究,我们利用核转染技术将带有pEF1alpha启动子的红色荧光蛋白质粒转染进入胚胎干细胞内以获得稳定表达的细胞系。并对该细胞系进行多能性功能的分析,为再生医学和疾病模型提供重要的材料。
  研究目的:
  建立稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系,并对该细胞系进行诱导分化的研究。
  研究方法:
  1.用核转染的方法将红色荧光表达质粒pEF1α-DsRed-Express2转染进入胚胎干细胞内,并用G418药物筛选单克隆;
  2.用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和RT-PCR方法检测转染红色荧光蛋白的胚胎干细胞(RFP-hESCs)多能性基因的表达;
  3.在体外对RFP-hESCs进行诱导分化鉴定其分化潜能;
  4.Primed状态的RFP-hESCs向Na(i)ve状态逆转诱导。
  实验结果:
  1.成功获得了稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系;并且经过鉴定RFP-hESCs仍然具有干细胞的特性,并且Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达与hESCs为出现明显差异;
  2.将RFP-hESCs诱导分化生成类胚体,并且有三胚层特异性基因的表达;进一步诱导分化生成定型内胚层细胞,qRT-PCR结果显示,定型内胚层细胞特异性基因有表达,干细胞特异性因子几乎不表达;
  3.得到Na(i)ve-like的细胞,但是该细胞不能继续传代。
  结论:
  成功建立稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系,并且没有影响该细胞系的干细胞特性,能够继续诱导分化生成其他类型的细胞,可用于后续实验的研究。
摘要:目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系.方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中.利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性.结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性.核转染前后hESCs的Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达未出现明显差异.RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上.结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究.
摘要:目的:培育用于异种移植的新型基因改造猪,在α-Gal基因敲除以及膜辅蛋白CD46、血栓调节蛋白( TM)基因转入的基础上,进一步将Ⅱ类反式激活因子基因N端缺失显性负向(CⅡTA-DN)基因转入猪胎儿成纤维细胞,以抑制猪白细胞抗原(SLA)Ⅱ类分子的表达。方法设计合成博来霉素( Zeocin)抗性基因片段,并将其与含有CⅡTA-DN基因的pST205载体连接,构建置于人Tie2增强子和CMVβ-actin启动子下游的pNMU105/CⅡTA-DN表达载体,将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B(DKO/CD46/TM)。 Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞,PCR方法检测CⅡTA-DN基因在181 B细胞中的转入,获得阳性单克隆并进行核移植,得到DKO/CD46/TM/CⅡTA-DN转基因猪。取仔猪的耳缘组织裂解后进行基因鉴定。结果成功设计Zeocin抗性基因片段并构建pNMU105/CⅡTA-DN表达载体,经过质粒转染和Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆,顺利通过核移植得到转基因猪。仔猪耳缘组织经PCR鉴定,在592 bp位置检测到预期条带,证明均为CⅡTA-DN转基因阳性。结论通过新型基因改造猪的培育,在抑制超急性排斥反应和补体反应、降低凝血和人CD4+T细胞免疫反应的理论基础上进行了转基因模型猪的构建,为异种移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活做出了新的尝试。
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