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摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能,在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素.本实验探究了ROS在小鼠(Mus musculus)体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响.本研究使用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2'-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride,AAPH)处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理前后与线粒体活性相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用qRT-PCR检测ROS相关基因、线粒体转录因子A(mitochondrialtranscription factorA,TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数.研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高.1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,qRT-PCR结果显示,处理组TFAM基因的表达量明显高于对照组.以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体转录因子A表达增强,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡.本研究初步探究了ROS与线粒体相关功能变化的关系,为揭示卵母细胞成熟机制和优化哺乳动物胚胎体外培养体系提供了参考.
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
摘要:脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,在组织器官修复方面具有潜在应用前景.体外培养条件下脂肪间充质干细胞增殖活性和分化潜能的维持对其应用研究具有重要意义.该研究通过大鼠腹股沟部脂肪组织分离获得了脂肪间充质干细胞,并对其细胞生长曲线、细胞群体倍增时间、细胞克隆形成等进行了检测,从而筛选出细胞生长最适的血清及浓度;再进一步对筛选条件下培养的大鼠脂肪间充质干细胞进行了免疫荧光检测、流式细胞术分析和诱导分化能力鉴定.结果显示,大鼠脂肪间充质干细胞在20%血清浓度下生长状态最好,增殖较快,细胞群体倍增时间较短,细胞克隆形成率可达(27.33±0.58)%.分离的大鼠脂肪间充质干细胞中CD44、CD90、CD106的阳性率分别为99.12%、99.59%、65.81%,CD34分子呈阴性.诱导后,细胞经油红O、碱性磷酸酶、阿新兰染色,结果表明,细胞具有向脂肪、骨、软骨方向分化的潜能.以上结果表明,成功建立了大鼠脂肪间充质干细胞系.
摘要:该研究探讨了人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)提取物对人肺腺癌细胞A549增殖和迁移能力的影响及其作用机制.利用超声破碎法制备hUC-MSCs提取物,并处理经链球菌溶血素O(streptolysin O,SLO)通透的A549细胞.采用MTT法、平板克隆形成实验检测hUC-MSCs提取物对A549细胞增殖的影响,Transwell实验检测细胞迁移能力,实时荧光定量PCR检测促凋亡基因胱冬肽酶-3(caspase-3)、胱冬肽酶-9(caspase-9),抑癌基因RUNX3(runt-related transcription factor 3)和存活蛋白基因(survivin)的rnRNA水平,亚硫酸氢盐测序检测R UNX3启动子区CpG岛甲基化水平.结果发现,经hUC-MSCs提取物处理后,A549细胞的增殖、迁移能力均显著降低,caspase-3、caspase-9和RUNX3 mRNA水平显著升高,survivin mRNA的表达量显著降低,UNX3启动子区CpG岛显著去甲基化.该研究结果表明,hUC-MSCs提取物可能通过逆转RUNX3启动子区甲基化状态恢复其表达,并通过提高caspase-3、caspase-9表达及降低survivin的表达来抑制A549的增殖及迁移能力.
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