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[硕士论文] 张柳
临床检验诊断学 温州医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  研究内源性神经酰胺对于THP-1细胞各种炎症因子基因表达的影响,尤其是对白细胞介素(IL)-6的影响及其相关机制;研究内源性神经酰胺对于仓鼠肝脏组织炎症影响,及其与脂代谢和相关microRNA的相关机制。进一步明确神经酰胺与炎症、脂代谢的关系,及其意义。
  方法:
  1、THP-1细胞的体外培养,分为对照组、Myriocin抑制神经酰胺合成组、Palmitate促进神经酰胺合成组、PA+M组。Myriocin终浓度为50μmol/L,Palmitate终浓度为500μmol/L。Myriocin干预2h,再加入Palmitate培养16h。利用LC-MS法检测各组不同类型的神经酰胺的含量。
  2、利用Real-time PCR法检测各组细胞及两组仓鼠的IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α的mRNA的表达水平,及两组仓鼠的miR-486的表达水平
  3、用ELISA法检测各组THP-1细胞上清中IL-6的释放量。
  4、利用Westernblot法检测各组细胞质IκBα与细胞核NF-κBP65蛋白的表达水平。
  5、利用流式细胞仪检测各组细胞ROS的水平。
  6、利用海马生物能量代谢测定仪XF96检测各组细胞的基础代谢率、ATP产量、最大呼吸能力、储备呼吸能力。
  7、各组细胞DNA的IL-6甲基化的检测。
  8、利用高果糖饮食制造仓鼠模型,LC-MS法检测两组组不同类型的神经酰胺的含量。
  9、用ELISA法检测两组仓鼠血清中VLDL、HDL、LDL的含量。
  结果:
  1、PA组各种类型的神经酰胺均有所升高,PA+M组又较PA组有所下降。
  2、内源性神经酰胺促进THP-1细胞合成释放IL-6,但却没有促进TNF-α、IL-1β、IL-18的表达。
  3、内源性神经酰胺增加IκBα的降解及核内NF-κBP65水平。
  4、神经酰胺能降低细胞的ATP产生、最大呼吸能力、储备呼吸能力。
  5、四组细胞IL-6基因甲基化情况没有差异。
  6、HFD组仓鼠较对照组仓鼠各种类型的神经酰胺均有所升高。
  7、HFD组仓鼠较对照组仓鼠miR-486表达量下降。
  8、HFD组仓鼠较对照组仓鼠IL-6 mRNA的表达量升高。
  9、HFD组仓鼠较对照组仓鼠血清中VLDL、HDL、LDL含量升高。
  结论:
  本实验证明内源性神经酰胺可以特异性促进THP-1细胞IL-6的基因表达,这种作用可能与其能够刺激NF-κB活化有关。同时,内源性神经酰胺对线粒体功能有所影响。成功通过高果糖饮食建造神经酰胺升高模型,仓鼠实验证实神经酰胺与miR-486的表达、VLDL、HDL、LDL的含量、有相关性。同时,仓鼠肝脏神经酰胺还可促进肝脏IL-6的mRNA的表达。
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CSTPCD 北大核心
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摘要:为研究A/Anhui/1/05(H5N1)及A/Ohio/07/2009(H1N1)两株病毒神经氨酸酶(NA)茎部(stalk)区域和半胱氨酸(Cysteine,C)对流感病毒生物学特性的影响.A/Anhui/1/05(H5N1) NA(命名为AH N1)的stalk区域相对A/Ohio/07/2009 (H1N1) NA存在20个氨基酸的缺失(其中包括一个半胱氨酸),将A/Ohio/07 /2009(H1N1)NA(命名为09N1)的stalk区域的20个氨基酸(命名为s20)缺失构建09N1-s20,相应部分插入至H5N1的NA中构建AH N1+s20.同时为了研究stalk区域半胱氨酸对NA功能的影响,构建了AH N1+C和09N1-C(stalk区域加/减一个半胱氨酸).运用假病毒颗粒系统研究stalk区域和半胱氨酸对病毒学特性的影响.09N1-C与09H1配对(09H1::09N1-C),其感染力比野生型09H1::09N1增强了8倍;AH N1+C与AH H5配对(AH H5::AHN1+C),其感染力比野生型AH H5::AH N1大幅度降低.09N1-s20与09H1配对(09H1::09N1-s20),其感染力为野生型09H1::09N1的4倍;AH N1+s20与AH H5配对(AH H5::AH N1+s20),感染力为野生型AH H5::AH N1的1/7.09N1-C与AH H5搭配,其感染力是AH H5::09N1的6倍;AH N1+C与09H1搭配其感染力相当低.蛋白聚合研究显示2009H1N1野生病毒的NA蛋白聚合体特征为:二聚体>>四聚体>单体;09N1-C蛋白聚合体特征为:单体为主;09N1-s20蛋白聚合体特征为:单体>>二聚体.09N1中删除半胱氨酸或敲除s20片段没有改变其蛋白的正常表达.AH N1聚合体特征以单体为主;AH N1+ s20蛋白聚合特点为:二聚体>>>单体>四聚体;而AH N1+C聚合体特征为二聚体多于四聚体.研究显示:2009H1N1 NA茎部区域氨基酸缺失半胱氨酸后,感染力增强;安徽H5N1的NA茎部区域添加半胱氨酸后感染力大幅降低,半胱氨酸的缺失对流感假病毒感染力增强起了重要作用.
摘要:Mitoferrin-1 (MFRN1)是溶质携带蛋白家族的一员,是线粒体内膜上最主要的铁运输蛋白.为了观察MFRN1过表达对293T细胞生长及线粒体功能的影响,采用包装慢病毒和感染293T细胞的方法构建MFRN1稳定过表达的细胞模型(293T-MFRN1),并对其线粒体功能进行评价.构建的稳定细胞株293T-MFRN1中MFRN1转录水平及蛋白表达水平显著增加(P<0.01),MFRN1过表达细胞线粒体内总铁的含量明显增加(P<0.05);电镜显示线粒体结构损伤,线粒体嵴减少、空泡化;线粒体能量代谢受抑制,细胞ATP含量显著下降,腺苷酸池总量(ATP+ADP+AMP)比对照组减少约40%;细胞生长受到抑制,在细胞培养48 h后高表达组细胞数量显著低于对照组;细胞内羟自由基(·OH)含量增加;线粒体DNA发生明显的氧化损伤.以上表明,MFRN1表达量的稳定对细胞功能极为重要,表达量异常增加将导致细胞线粒体功能障碍、细胞增殖抑制.
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