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摘要:为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析.结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14 d后的结瘤数明显减少....
[期刊论文] 张恒 尹珺 张晴 张忠明
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CSTPCD 北大核心
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摘要:为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白.结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性....
[期刊论文] 张晴 余海翔 张忠明
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CSTPCD 北大核心
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摘要:为了阐明豆科植物共生反应与免疫反应的协调机制,揭示参与植物细胞侵染、定殖及固氮过程中根瘤菌基因的功能,以苜蓿中华根瘤菌Sm2011为材料,构建了约8 000株Tn 5-sacB转座子插入的突变体库.利用巢式PCR检测技术,从中鉴定和筛选出nodC、nifH、smc01188和smc04024等4个特定目标基因的插入突变体及其插入位点.通过结瘤试验考察突变体共生及固氮表型,结果显示:植株接种smc01188突变体28 d后,与对照植株相比,该基因突变导致根瘤固氮酶活下降,与慢生型大豆根瘤菌该基因突变体的表型类似;smc04024基因突变不影响植株生长,根瘤发育基本正常;接种ni fH突变体后,植株呈缺氮表型,生长发育受阻,根瘤为白色;接种nodC突变体后植株不结瘤,说明Tn5-SacB的插入导致nifH、nodC基因功能丧失.利用PCR检测、鉴定和分离目标基因突变体是一种行之有效的方法....
[硕士论文] 张晴
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:豆科植物与根瘤菌共生形成一个特殊的器官-根瘤,根瘤是根瘤菌共生固氮的场所,其形成和发育都是根瘤菌与宿主植物相互作用的结果。在豆科植物中,存在两种不同形态的根瘤:即定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的分生组织活性周期短,且根瘤各个组织的发育阶段一致;不定型根瘤的分生组织活性延续时间长,根瘤菌则持续感染其分生组织,导致根瘤有明确的分生区、侵染区、固氮区和衰老区,各个区域处于不同的发育阶段。模式豆科植物蒺藜苜蓿根瘤属于不定型根瘤,其共生伙伴-苜蓿中华根瘤菌在侵染区与固氮区间开始分化成类菌体并行使固氮功能。为了揭示根瘤菌在根瘤中侵染、存活、定殖分化及固氮的机制,本研究以中华苜蓿根瘤菌Sm2011菌株为材料,开展了共生固氮相关基因突变体分离和鉴定的工作,主要研究结果如下:
  1.构建了苜蓿中华根瘤菌Sm2011菌株的突变体库:利用三亲本杂交技术,以Sm2011为受体,以E.coli S17-1/pMH1701为供体、E.coli/pRK2073作为辅助菌进行三亲本杂交。其结果表明,Tn5-sacB转座频率为1.84×10-6,经Km抗性、蔗糖敏感及Tc抗性筛选,分离得到约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体。随机挑选23个单菌落,通过PCR证实Tn5-sacB插入在根瘤菌基因组。
  2.筛选根瘤菌抑制苜蓿根瘤免疫相关基因的突变体:蒺藜苜蓿抑制根瘤免疫基因突变体(nad1),在接种野生型根瘤菌时,形成不能固氮根瘤(白色)。利用该突变体的根瘤表型,接种Tn5-sacB插入突变的根瘤菌,尝试筛选出能形成粉红色的根瘤。结瘤实验结果表明,在约1600棵nad1缺陷型植株中,未发现有结粉红色根瘤的植株。说明利用该方法难以筛选到根瘤菌恢复nad1突变体结固氮根瘤的表型。
  3.苜蓿根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定:利用巢式PCR检测技术,从约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体库中鉴定和筛选出4个特定目标基因的插入位点及其突变体,即固氮酶基因nifH-75-9,结瘤基因nodC-32-33,肽聚糖相关基因smc04024-76-79和smc01188-11-80,其中只有smc04024的插入位点位于基因F端上游,其他三个突变体中Tn5均插入在基因序列中。通过结瘤实验,考察突变体共生及固氮表型,得到野生型苜蓿种子接种nifH基因突变体28d后,形成不能固氮根瘤(白色);接种nodC基因突变体10d后,不能形成根瘤。该结果与已经报道的结果完全一致,证实了突变体库的完整性。而在接种smc01188基因突变体28d后,所得到的根瘤虽然呈粉红色,但红色区域较野生型根瘤大大减少,且植株叶片背面呈红褐色,植株呈现一定程度的缺氮表型;接种smc04024基因突变体28d后,植株根瘤及叶片与接种野生型根瘤菌相比基本相同,这说明该基因的插入位点未破坏该基因的正常表达。此举为鉴定苜蓿根瘤菌突变体提供资源及筛选程序,为后续深入研究根瘤菌共生固氮调节的分子机制提供科学资料。
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