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摘要:基于化学酶标记和丙酮富集糖肽方法,建立了一种可靠、有效、简单的糖蛋白N-糖链分析方法.以唾液酸糖肽(SGP)为模型糖肽,比较了样品中丙酮加入量对SGP的富集效果,最终选择加入样品体积5倍量的丙酮.用丙酮富集经胰蛋白处理的核糖核酸酶B(RNase B)酶解液中的糖肽,以富集分离得到的糖肽(糖基供体)和PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(糖基受体)作为酶反应底物,进行Endo-M N175Q的转糖基反应,得到PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc-N-糖链标记物.采用YMC C18色谱柱为分析柱,10 mmol/L甲酸铵-乙腈为流动相梯度洗脱,经液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测得到5种高甘露糖型糖链.结果表明,丙酮可有效地富集大量肽和少量糖肽混合溶液中的糖肽,Endo-M N175Q可将天然糖肽的糖链转移到PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc受体上.将该方法应用于胎球蛋白N-糖链分析,检测到5种复杂型N-糖链.该研究为各种糖蛋白N-糖链检测提供了新的分析方法....
[硕士论文] 张斯然
化学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,以质谱为分析平台的糖链分析研究取得了很大程度进展。糖链的释放和衍生化等样品制备方法不断得到丰富和改进,糖链的各种分析策略相继建立起来,本文主要对糖链的定性分析方法做分析和总结。本论文采用化学酶标记法,酶标记是糖基化分析的最有前途的方法之一,因为其简单:标记发生在酶消化过程中,可以避免额外的试剂,额外的步骤和副反应。化学酶法因其温和的反应条件、高度的空间区域选择性,避免了化学合成繁琐的保护步骤而成为研究的热点,为研究糖蛋白中的N-糖链,提供了新的思路。
  第一章绪论的主要内容是糖蛋白糖链现状以及与疾病有哪些关联,并且详细说明糖蛋白的组成结构和应用。目前研究糖链的方法多用PNGase F酶,但本文使用了胰蛋白酶,所以绪论部分对此进行了简短介绍和说明,同时对最后一步转糖基酶Endo-M N175Q的作用及优点做出详尽解释。
  第二章实验部分,着重说明实验所需各种溶液的配制,以及实验过程中涉及的脱盐,胰蛋白酶切,丙酮富集糖肽,酶反应条件及方法,并且通过最后优化的方法对三种标准品进行定性检测分析,结果较好。
  第三章结果与讨论中,着重探讨了三种糖蛋白分析方法,其中方法一是糖蛋白在Endo-M N175Q的作用下,直接将寡糖转移到受体上。方法二使用PNGase F酶对糖链进行分析,将寡糖转移到受体。而第三种方法是本文着重讨论的方法,用胰蛋白酶将糖蛋白酶切,对肽链进行丙酮富集,而现在大多数论文的一般方法都是对肽段进行分析,而本文方法具有新颖性,采用丙酮富集糖肽的方法,将寡糖转移至受体后与175Q酶反应,经过谱图检测后发现丙酮富集糖肽方法效果非常好,随后细致的探讨了各步骤反应条件优化情况,确定了最终方法。然后将此方法应用于三种标准糖蛋白,分别是牛胰核糖核酸酶B,卵清蛋白,胎球蛋白。
  其中着重突出了丙酮在-25度冰柜中,以及5倍体积量富集糖肽效果最好,检测到的糖肽链最多。通过糖链在丙酮和水中的溶解度不同,而形成清液和沉淀,接着对沉淀进行丙酮富集,得到丰富的糖链信息。最后用Endo-M的突变体175Q酶进行转移,效率高,结果好。以牛胰核糖核酸酶B共检测到5种糖链,分别是M5N2,M6N2,M7N2,M8N2,M9N2。卵清蛋白检测到5种,分别是M5N2,M6N2,M8N2,M3N4,M3N6。胎球蛋白检测到6种,分别是M3N4G2,M3N4G2Ac2,M3N4G2Ac3,M3N5G3Ac, M3N5G3Ac2,M3N6G4Ac4。本文建立高效、高选择性的丙酮富集糖肽方法,利用175Q酶转糖基反应特性,使用化学酶衍生化法对糖蛋白进行定性定量分析。
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