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摘要:目的 建立荧光定量PCR (qPCR)对流产衣原体的检测方法.在流产衣原体灭活疫苗的生产中,代替具有主观判断影响的涂片染色疫苗效价检测方法.方法 根据流产衣原体富含半胱氨酸的胞质蛋白(envB)基因保守序列设计特异性引物,利用 EnvB-PMD19T阳性质粒为参考标准品,优化了反应条件,进行了敏感性、特异性及重复性试验,检测了感染流产衣原体小鼠的菌体载量.结果 以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1×102copies/μL~1×106copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为97%.灵敏度试验表明,该检测方法的最低检出限低至10 copies/μL.组内、组间重复性试验的变异系数均小于2 %,具有良好的重复性和稳定性.消化道检测到的菌体载量高于腹腔注射的菌体载量.结论 本研究建立的方法能够有效的检测小鼠相应脏器的菌体含量,为流产衣原体灭活疫苗的效检提供可靠的检测方法.
[期刊论文] 张志君 周继章
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CSTPCD 北大核心
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摘要:流产衣原体(Chlamydia abortus)属于衣原体科(Chlamydiaceae)、衣原体属(Chlamydia),系一类细胞内寄生的革兰阴性原核型微生物.流产衣原体导致羊的流产、死胎,严重威胁养羊业.流产衣原体不仅可以感染羊,还可以感染怀孕妇女.在病原的诊断方面,分子生物学技术因其快速与相对灵敏性的优点得到快速发展,然而细胞分离培养仍然是鉴定流产衣原体的"金标准".在防治方面,疫苗免疫是预防流产衣原体的理想措施,在我国流产衣原体灭活疫苗已获得国家一类新兽药证书并可以为羊提供有效地免疫保护.疫苗与抗菌药物的合理使用可以为羊群提供很好的保护.
[硕士论文] 张志君
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:流产衣原体(C.abortus)可以导致妊娠母畜后期如牛、羊、猪的流产、死胎。流产衣原体也是一种人兽共患病原,接触过患病家畜的妇女也可发生流产、死胎。通常情况下,初次感染流产衣原体的羊群流产率达到30%以上,感染羊会发生流产、死胎、弱胎。在第二次产羔季节,未治疗的羊群流产率为5%-10%。疫苗作为预防传染性疾病的重要手段和措施,对预防动物性传染性疾病和保护人类健康安全起到了非常重要的作用。在研究牦牛衣原体灭活疫苗的过程中,发现流产衣原体灭活疫苗对牦牛衣原体的流产似乎具有某种治疗效果,具有大幅度降低流产率的作用。
  本研究建立荧光定量PCR(qPCR)对流产衣原体的检测方法。根据的胞质蛋白(envB)基因设计特异性引物,利用EnvB-PMD19T阳性质粒为参考标准品,优化了反应条件,进行了敏感性、特异性及重复性试验,检测了感染流产衣原体小鼠的菌体载量。以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1×102copies/μL~1×106copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为97%。灵敏度试验表明,该检测方法的最低检出限低至10copies/μL。组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。
  本研究利用Balb/c小鼠为试验模型,通过腹腔和消化道两种途径接种流产衣原体,用已经建立的实时定量PCR的方法对两种不同途径感染的小鼠进行检测,结果表明,脾脏、子宫、肝脏、十二指肠在感染14天时的流产衣原体菌体载量最高。两种途经感染小鼠的各个器官,同一时间内的IFU基因组拷贝数存在一定差异,但C.abortus在相同组织器官中的定植和繁殖规律完全相同,表明C.abortus对各组织器官的嗜性有明显的规律。
  本研究通过感染流产衣原体的Balb/c小鼠,对羊流产衣原体灭活苗治疗机制进行了初步的探讨。小鼠在感染流产衣原体后14天,进行疫苗注射。将试验组分为对照组0μL(C),低剂量组50μL(LD)和高剂量组100μL(HD),开展小鼠组织中菌体拷贝数检测,外周血抗体效价检测,组织病理切片和免疫组化观察,外周血细胞因子检测。结果表明,LD组与C组相比,菌体基因组拷贝数明显减少,免疫组化阳性标记率低,抗体滴度高;细胞因子在开始检测的一周时间内,HD组的抑炎细胞因子IL-4是逐渐下降,反之,LD组的IL-4是上升,而且要高于HD组和C组。HD组的促炎细胞因子IL-6、TNF-α要高于LD组和C组。除此之外,LD组的促炎细胞因子TNF-α并未检测到。上述结果表明,低剂量的灭活疫苗可以有效抑制感染小鼠体内的衣原体复制。
  综上所述,本研究成功建立了羊流产衣原体实时定量PCR方法,并在此方法的基础上证实衣原体灭活疫苗可以抑制感染小鼠体内的衣原体增殖。为更好的指导流产衣原体油乳佐剂灭活疫苗在临床上的使用具有重要的意义。
摘要:为建立一种快速、准确的动物衣原体检测方法,本研究基于动物衣原体的保守基因envB的序列,设计并合成引物与探针,建立了一种动物衣原体特异性重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法.该检测方法在37~39℃恒温反应20 min,即可实现对动物衣原体目的基因片段的有效扩增,并具有高灵敏度的特点,最低检测限为101 copies/μL,同时利用建立的RPA检测方法和普通PCR方法对10份临床样品进行衣原体检测,结果阳性检出率完全一致.表明,本研究建立的动物衣原体RPA检测方法操作简单方便、灵敏度高,短时间内能获得准确可靠的诊断结果,对动物衣原体的临床检测和疾病诊断提供了一种新的、可靠的技术支持.
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