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[硕士论文] 张国华
生物工程 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:抗生素的滥用在我国的临床医学和畜牧业中广泛存在,诱发大量病原菌产生了耐药性,甚至产生能免疫多种抗生素的超级细菌,严重威胁着人类的健康,寻找一种有效的抗生素替代品迫在眉睫。与传统抗生素相比,抗菌蛋白无毒、无残留、不污染环境且不易产生耐药性,是抗生素的理想替代物。
  本研究从本室保藏的菌种中筛选到了一株有良好抑菌能力的菌株P7,并利用多种分类法,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过不同浓度的饱和硫酸铵沉淀,确定Bacillus subtilis P7发酵上清中抗菌物质的最适沉淀浓度为40%。得到的蛋白粗提物具有良好的热稳定性和pH稳定性,在100℃下处理30分钟仍有56%的相对抑菌活性,pH3-10之间抑菌活性变化较小。胃蛋白酶(pepsase)和胰蛋白酶(trypsin)处理后粗提物活性没有变化,但蛋白酶K(proteinase K)处理后抑菌活性丧失,因此推测抗菌物质中可能是蛋白质或其衍生物。蛋白粗提物透析后用SephadexG-75柱层析纯化,呈现两个洗脱峰,将其命名为M1和M2。对这两个峰的收集液进行活性验证,发现M1无抑菌活性,M2有抑菌活性。将M2峰的蛋白用超滤管浓缩,用SDS-PAGE凝胶电泳检测,得到单一的蛋白条带,分子量大约为25kDa。将蛋白条带进行 MALDI-TOF-MS质谱鉴定,结果表明 M2峰的蛋白与枯草芽孢杆菌中的蛋白 CM50-07410同源性的最高,质谱鉴定的肽段与该蛋白的氨基酸序列的一致性为45%。同时对抗菌蛋白的抑菌机理进行了初步探究:电镜检测用纯化后的抗菌蛋白处理的金黄色葡萄球菌菌体,发现处理后的菌体表面出现褶皱,处理时间越长细胞膜结构破坏越明显。表明抗菌蛋白确实能破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的结构。
  在NCBI中检索蛋白CM50-07410的核酸序列,设计引物从Bacillus subtilis P7的总DNA中扩增出了anti1基因,并成功构建了重组质粒pGEX-6p-anti1,但是抗菌蛋白表达之后没有抗菌活性,是否因为抗菌蛋白本身需要修饰,而大肠杆菌无修饰功能导致抗菌蛋白没有抑菌活性,尚需要进一步验证。
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北大核心 AJ CA CBST
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摘要:长江上游是我国淡水鱼类种质资源最为丰富的地区之一.上游干、支流及其附属湖泊内,共分布有鱼类261种,包括国家一级保护野生动物白鲟、达氏鲟和中华鲟,二级保护野生动物胭脂鱼和川陕哲罗鲑.除珍稀鱼类外,长江上游分布有112种特有鱼类,占上游鱼类总数的42.95%(1).特有种所占比例之高,超过国内其它任何地区或水系.三峡工程建成后,将引起水域生态改变,并将使约40种鱼类受到不利影响(2).
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