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摘要:为研究鹅β-防御素1(AvBD1)的生物学特性以及初步尝试探寻其抗肠炎沙门菌的作用机理,利用RT-PCR方法从鹅骨髓组织中扩增到鹅AvBD1基因片段,并将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鹅AvBD1蛋白在原核高效表达(相对分子质量约31 ku).该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性.结果显示,鹅AvBD1基因cDNA片段大小为198 bp,编码65个氨基酸残基.经相似性分析发现鹅AvBD1氨基酸序列与鸵鸟AvBD1氨基酸序列相似性最高,为77.1%,而且重组鹅AvBD1蛋白具有广谱的抗菌活性,对12种细菌(包括革兰阳性菌和革兰阴性菌)均具有抑菌作用.高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD1蛋白的抗菌活性,且该重组蛋白的溶血活性极低.试验表明,肠炎沙门菌确实会诱导鹅AvBD1基因在鹅骨髓组织中的表达,说明鹅AvBD1起到了抗肠炎沙门菌感染的作用,而这种作用有可能与TLR4介导的信号转导有关....
摘要:从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性.应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性.测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基.经遗传进化分析发现,该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高,分别为87.9%和78.8%,这两组氨基酸序列的同源性为83.3%.因此,将其分别命名为鸽AvBD5α(骨髓)和鸽AvBD5β(肝脏).进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达.两个重组融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,及其融合蛋白的溶血活性.结果表明,重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa.具有明显的抗菌活性,对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性显著影响.此外,这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性....
摘要:[研究目的]旨在克隆与表达鸭β-防御素16 (AvBD16)基因及测定其生物学特性,监测了鸭肝炎病毒感染后麻鸭不同组织AvBD16与TLR-7的动态变化.[方法]采用RT-PCR方法,从鸭骨髓组织中扩增到鸭AvBD16,并将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对其重组和合成蛋白进行生物学活性测定.采用荧光定量PCR方法,分别检测了鸭肝炎病毒对鸭AvBD16和TLR-7在不同组织中表达量的影响.[结果]鸭AvBD16 cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性最高,为62%.重组和合成鸭AvBD16蛋白对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响,且溶血活性极低.重组AvBD16蛋白具有体外抗病毒活性.经鸭肝炎病毒诱导后,鸭AvBD16在肝脏及其他组织中被诱导表达或表达量显著上调,且与TLR7的表达量呈正相关.[结论]成功克隆并表达了鸭AvBD16基因,重组和合成AvBD16蛋白具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性.重组AvBD16蛋白具有抗鸭肝炎病毒的活性,体内抗病毒作用可能受TLR-7通路调节....
摘要:为克隆与表达鸭β-防御素5 (AvBD5)基因及测定其生物学特性,采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨 基酸序列构建进化树进行同源性分析.结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基,分别在分子内形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6共3对二硫键,与鸡AvBD5氨基酸同源性高达97%.进一步将其亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达.重组GST融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,以及该重组GST融合蛋白对溶血活性的影响.鸭AvBD5重组蛋白分子量约为32 kD,具有良好的抗菌活性,对11种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响.此外,该重组蛋白对红细胞溶血活性极低....
摘要:本研究旨在克隆与表达鸭β防御素4(AvBD4)基因及测定其生物学特性,并检测其在鸭脏器组织中的分布.采用RT-PCR方法从鸭法氏囊组织中扩增到鸭AvBD4,其cDNA大小为171 bp,编码56个氨基酸.经同源性分析,鸭AvBD4与鸡AvBD4的氨基酸序列同源性最高,达73.2%.将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD4.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃进行诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鸭AvBD4蛋白的相对分子质量约为32 ku,与预期大小一致.该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性,结果显示,重组鸭AvBD4蛋白具有广谱的抗菌活性,对11种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用.在高盐离子条件下,重组鸭AvBD4蛋白仍具有抑制金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌的作用.此外,该重组蛋白的溶血活性极低.运用实时荧光定量PCR法检测到该基因在鸭组织器官中表达局限,仅在盲肠扁桃体、脾脏和法氏囊中表达....
摘要:利用2种咖啡渣(C1和C2)作为吸附剂,从水溶液中吸附去除亚甲基蓝(MB).使用扫描电子显微镜和X射线衍射仪等分析技术表征咖啡渣材料.研究了溶液pH值、吸附剂用量和接触时间对MB去除的影响.结果表明,pH值从2.0升高到12.0对C1吸附MB的影响很大,MB的去除率随着pH值的升高而升高.50 mg/L的MB溶液吸附1 h时,C1和C2对MB的去除率分别为94.41%,88.26%.随着C1和C2投加量的增大,MB的去除率也在增大.使用Langmuir模型分析实验数据,在25℃下,C1对MB的最大吸附容量为344.8 mg/g,C2的最大吸附容量为163.9 mg/g....
[硕士论文] 张可心
生态学;资源环境生态学 东北农业大学 2019(学位年度)
摘要:大豆是我国的传统出口产品,东北大豆在历史上也曾远销世界多个国家和地区.因此,从黑龙江省大豆生产的发展特点,面临的机遇和挑战,以及如何发展黑龙江省大豆生产的出路3个方面展开研究,为黑龙江省大豆未来的发展提供指导依据....
摘要:本研究采用RT-PCR方法,分别从鸭肺脏和骨髓组织中扩增到5个新的β-防御素基因,将测序结果与已发现的禽β-防御素(AvβD)和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树并进行同源性分析.结果显示,这5个基因分别是鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6和鸭AvBD16.其中,鸭AvBD1 eDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸,与鸵鸟AvBD1氨基酸同源性最高为78%;鸭AvBD3 cDNA大小为182 bp,编码60个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD5cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,与鸡AvBD5氨基酸同源性达97%;鸭AvBD6 eDNA大小为204 bp,编码67个氨基酸残基,与鸡AvBD6氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD16 cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸,与鸡AvBD3同源性最高,为62%.将这5个鸭AvBD基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21,进行IPTG诱导表达.将表达的蛋白进行纯化,同时根据其各自的氨其酸序列分别合成相应的5条多肽.以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌,采用菌落计数法测定重组和合成的鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6、鸭AvBD16和GST蛋白的抗菌活性,以及盐离子浓度对其抗菌活性的影响.并对这些蛋白的溶血活性进行测定.结果表明,与GST标签蛋白相比,重组和合成鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6和鸭AvBD16蛋白对12种细菌均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01).在高盐浓度下,这些蛋白对四联球菌和多杀性巴氏杆菌的抗菌活性显著降低(P <0.05或P<0.01).此外,这些蛋白溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P>0.05).本试验还测定了这5个重组蛋白的体外抗鸭肝炎病毒作用,结果表明,与阳性对照(病毒组)相比,这些重组蛋白显著延长了鸭胚的存活时间(P <0.05或P<0.01),相反地,GST无显著作用(P>0.05),表明这些重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的作用.为探讨这些鸭AvBDs基因在体内组织中的表达水平是否受鸭肝炎病毒诱导,及其抗病毒作用的信号转导机制.本研究以鸭肝炎病毒感染鸭,采用荧光定量PCR方法,分别检测了攻毒后24h、32h、48h、72h、96h鸭体内法氏囊、脾脏、胸腺、盲肠扁桃体、骨髓、肝脏、肾脏和肺脏组织中这5个鸭AvBDs基因的表达量,以及几个细胞因子:鸭白介素-2(IL-2)、白介素-18 (IL-18)和γ干扰素(IFNγ),以及Toll样受体7(TLR7)基因在除肾脏和肺脏外的上述组织中的表达量.结果显示,经鸭肝炎病毒诱导后,除鸭AvBD1、鸭AvBD3和IFN-γ在肝脏中没有被诱导表达外,其余基因在肝脏组织中均被诱导表达或表达量显著上调(P <0.05或P<0.01).此外,在攻毒后的各个时间点,也检测到这些基因在其他组织中发生诱导表达或表达水平显著上调(P< 0.05或P<0.01).同时,本试验结果还显示,这些防御素和细胞因子在组织中的表达量与TLR7的表达量呈正相关.结果提示,这些鸭AvBDs与细胞因子在体内的抗病毒作用可能受TLR7介导的信号转导通路调控.
摘要:本试验应用RT-PCR方法,从鹅的脾脏、骨髓和法氏囊等组织器官中扩增到3个新的鹅AvBDs基因.将其推导的氨基酸序列与其他β-防御素序列分析比较,结果显示这3个AvBDs基因分别为鹅β-防御素1(AvBD1)、鹅β-防御素3(AvBD3)和鹅β-防御素6(AvBD6).经核苷酸序列测定分析结果表明,鹅AvBD1cDNA由198个碱基组成,编码65个氨基酸残基;鹅AvBD3 cDNA由182个碱基组成,编码60个氨基酸;鹅AvBD6 cDNA由204个碱基组成,编码67个氨基酸残基.鹅AvBD3和鹅AvBD6与对应的鸡AvBD3和鸡AvBD6基因的同源性为100%,鹅AvBD1与鸵鸟AvBD1基因的同源性最高,为70.7%.将鹅AvBD1、3、6基因分别亚克隆到表达载pGEX-6p-1上,构建3个重组表达质粒pGEX-GooseAvBD1、3、6将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,后进行蛋白纯化.SDS-PAGE电泳表明,3种重组蛋白分子量为31 ~ 32kDa,3个重组菌的表达产物均以包涵体的形式存在.同时,根据这3个多肽的成熟序列,分别合成3个合成多肽(sAvBD1、3、6).选用4株革兰氏阳性菌(四联球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌)和8株革兰氏阴性菌(奇异变形杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、兔波氏杆菌)做为检测菌,利用菌落计数法测定抗菌活性,结果显示标签蛋白GST对各种细菌没有抑制作用;重组和合成蛋白对所测的12株细菌均具有不同程度的抑菌活性.本试验还以多杀性巴氏杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)作为试验菌,测定不同盐浓度对重组蛋白以及合成蛋白的影响,结果显示,随 着盐浓度的增加,其抗菌活性明显减弱,而在高盐浓度条件下,该重组蛋白仍具有抗菌活性.另外,对该重组、合成鹅AvBD1、3、6蛋白进行了溶血活性的试验,发现鹅AvBDs溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P>0.05).为探讨这3个鹅AvBDs的抗感染机制,本试验采用肠炎沙门氏菌人工感染15日龄东北籽鹅,分别于感染后6h、24h、48h、72h采取鹅部分组织样品,主要是免疫组织和肠组织,并用荧光定量PCR方法检测这3个基因,部分炎性细胞因子,及其鹅Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4的表达量.结果表明,受感染后,这3个AvBD基因在不同组织中的表达量变化较大,其中AvBD1基因在骨髓中的表达量显著提高,AvBD3基因在骨髓、脾和大肠中的表达量显著提高,AvBD6基因在免疫组织中的表达量都显著提高.以上结果说明了鹅AvBDs具有可诱导性.同时发现,TLR4,以及鹅白细胞介素(IL)-2,IL-18,γ干扰素(IFN-γ)基因的表达量也相应提高.本研究结果初步表明,受肠炎沙门氏菌感染后,鹅机体可能通过TLR4激活细胞信号转导途径,提供刺激分子,诱导由T细胞分化产生的两种鹅细胞因子(IL-2和IL-18)以及鹅干扰素基因(IFN-γ)和3种鹅AvBDs基因的表达,激活天然免疫反应,协同建立机体获得性免疫防御,共同抵御肠炎沙门氏菌对鹅机体的攻击.
摘要:为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性,本研究采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基,分别在分子内形成Cys1-Cys5,Cys2-Cys4,Cys3-Cys6共3对二硫键,与鸡AvBD5氨基酸同源性高达97%。进一步将其亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。重组GST融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,以及该重组GST融合蛋白对溶血活性的影响。鸭AvBD5重组蛋白分子量约为32 ku,具有良好的抗菌活性,对11种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响。此外,该重组蛋白对红细胞溶血活性极低。
摘要:为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性,本研究采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基,分别在分子内形成Cys1-Cys5,Cys2-Cys4,Cys3-Cys6共3对二硫键,与鸡AvBD5氨基酸同源性高达97%。进一步将其亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。重组GST融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,以及该重组GST融合蛋白对溶血活性的影响。鸭AvBD5重组蛋白分子量约为32 ku,具有良好的抗菌活性,对11种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响。此外,该重组蛋白对鸭血红细胞无明显溶血活性。
[硕士论文] 张可心
畜牧学;动物营养与饲料科学 东北农业大学 2012(学位年度)
摘要:防御素是广泛存在于动植物体内的一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,具有抑制细菌、真菌和囊膜病毒的作用,其独特的抗菌机制避免了传统抗生素易使细菌产生耐药性等问题,有望代替抗生素成为新型的饲料添加剂。禽抗菌肽属于β-防御素类,具有高效、广谱的抗菌活性,在禽类先天性免疫系统中发挥着重要作用。
   本研究采用RT-PCR方法,分别从鸭肺脏和骨髓组织中扩增到5个新的β-防御素基因,将测序结果与已发现的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳类动物β-防御索的氨基酸序列构建进化树并进行同源性分析。结果显示,这5个基因分别是鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6和鸭AvBD16。其中,鸭AvBD1 cDNA大小为198bp,编码65个氨基酸,与鸵鸟AvBD1氨基酸同源性最高为78%;鸭AvBD3 cDNA大小为182bp,编码60个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD5 cDNA大小为201bp,编码66个氨基酸残基,与鸡AvBD5氨基酸同源性达97%;鸭AvBD6 cDNA大小为204bp,编码67个氨基酸残基,与鸡AvBD6氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD16 cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸,与鸡AvBD3同源性最高,为62%。
   将这5个鸭AvBD基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21,进行IPTG诱导表达。将表达的蛋白进行纯化,同时根据其各自的氨其酸序列分别合成相应的5条多肽。以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌,采用菌落计数法测定重组和合成的鸭AvBD1、3、5、6、16和GST蛋白的抗菌活性,以及盐离子浓度对其抗菌活性的影响。并对这些蛋白的溶血活性进行测定。结果表明,与GST标签蛋白相比,重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白对12种细菌均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。在高盐浓度下,这些蛋白对四联球菌和多杀性巴氏杆菌的抗菌活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。此外,这些蛋白溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P>0.05)。本试验还测定了这5个重组蛋白的体外抗鸭肝炎病毒作用,结果表明,与阳性对照(病毒组)相比,这些重组蛋白显著延长了鸭胚的存活时间(P<0.05或P<0.01),相反地,GST无显著作用(P>0.05),表明这些重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的作用。
   为探讨这些鸭AvBDs基因在体内组织中的表达水平是否受鸭肝炎病毒诱导,及其抗病毒作用的信号转导机制。本研究以鸭肝炎病毒感染鸭,采用荧光定量PCR方法,分别检测了攻毒后24 h、32h、48 h、72 h、96 h鸭体内法氏囊、脾脏、胸腺、盲肠扁桃体、骨髓、肝脏、肾脏和肺脏组织中这5个鸭AvBDs基因的表达量,以及几个细胞因子:鸭白介素-2(IL-2)、白介素-18(IL-18)和γ干扰素(IFN-γ),以及Toll样受体7(TLR7)基因在除肾脏和肺脏外的上述组织中的表达量。结果显示,经鸭肝炎病毒诱导后,除鸭AvBD1、3和IFN-γ在肝脏中没有被诱导表达外,其余基因在肝脏组织中均被诱导表达或表达量显著上调(P<0.05或P<0.01)。此外,在攻毒后的各个时间点,也检测到这些基因在其他组织中发生诱导表达或表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。同时,本试验结果还显示,这些防御素和细胞因子在组织中的表达量与TLR7的表达量呈正相关。上述结果揭示,这些鸭AvBDs与细胞因子在体内的抗病毒作用可能受TLR7介导的信号转导通路调控。
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