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摘要:目的:探讨β-连环素(β-catenin)对人羊膜间充质干细胞( AMSC)增殖的影响。方法:将β-catenin-绿色荧光蛋白(β-catenin-GFP)重组腺病毒扩增后,转染人AMSC,在荧光倒置显微镜下观察转染效率。采用CKK-8法测定AMSC的细胞生长状况。结果:荧光观察证实β-catenin-GFP融合蛋白在AMSC细胞中获得有效表达,β-cate-nin稳定高表达的AMSCs增殖率明显高于正常的AMSCs,分别为50.0%、82.5%、92.6%、169.1%和128.2%。结论:在AMSC细胞中成功表达了β-catenin-GFP融合蛋白,β-catenin高表达能有效地刺激AMSC的增殖。...
[硕士论文] 张东丽
生物工程 郑州大学 2013(学位年度)
摘要:目的:
   构建含绿色荧光蛋白(GFP)标记、β-连环蛋白(β-catenin)特异的RNAi重组腺病毒表达载体,利用包装好的重组腺病毒感染羊膜间充质干细胞(AMSC),在转录后水平有效的抑制β-catenin的表达,探讨siRNA干扰β-catenin对AMSC增殖的影响。
   方法:
   利用脂质体将设计合成好的三个β-cateninsiRNA干扰片段瞬时转染AMSC,利用免疫印迹(WesternBlot)筛选最优的β-cateninsiRNA干扰片段;然后编码针对最优干扰片段,即CTNNB1短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的单链DNA,并通过退火反应获得目的基因双链DNA,将目的基因连接至腺病毒穿梭质粒中构建阳性重组质粒pAdTrack-si-β-catenin,经PmeI酶切线性化后使其在BJ5183菌中与腺病毒骨架质粒进行同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-si-β-catenin,利用脂质体将经PacⅠ酶切线性化后的重组腺病毒质粒转染至HEK293细胞,包装重组腺病毒、空斑实验测定病毒滴度。重组腺病毒感染AMSC,WesternBlot法检测AMSC中β-catenin及GSK-3β的表达情况,CKK-8法检测β-catenin沉默表达对AMSC增殖的影响。
   结果:
   1.β-cateninsiRNA干扰片段瞬时转染AMSC可以有效抑制β-catenin的表达,通过WesternBlot成功的筛选出了最优的目的基因靶序列,设计并合成了shRNA的DNA双链,并成功构建出重组腺病毒表达载体pAd-si-β-catenin;成功的包装、扩增出重组腺病毒,获得高滴度重组腺病毒。
   2.重组腺病毒感染AMSC后,在荧光倒置显微镜下可以观察到GFP表达,通过WesternBlot检测到重组腺病毒感染AMSC后可以有效的抑制β-catenin基因的表达,感染组β-catenin明显少于对照组。
   3.重组腺病毒感染AMSC后,通过CKK-8法检测细胞生长曲线,与对照组相比,感染组细胞的增殖受到明显抑制。
   结论:
   构建的特异RNAi重组腺病毒能够有效的抑制β-catenin基因的表达,减少了细胞内β-catenin的水平,且β-catenin的沉默表达可以明显抑制AMSC的增殖。
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