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摘要:胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用.将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测BmTHY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素rBmTHY增强家蚕抗病毒能力的可行性.qRT-PCR检测结果表明,感染BmNPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中BmTHY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染BmNPV后72 h,蚕体内BmTHY蛋白的表达水平下降42.3%.家蚕5龄幼虫接种BmNPV后,分别添食质量浓度为340 μg/mL(高剂量)、34 μg/mL(中剂量)和3.4 μg/mL(低剂量)的rBmTHY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%.研究结果初步证明BmNPV感染可降低蚕体及部分组织中BmTHY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量rBmTHY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗BmNPV病毒感染的能力....
[硕士论文] 廖金旭
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:家蚕是一种经济价值很高的鳞翅类昆虫,养蚕业是世界上发展中国家农业经济的主要来源。但是,由家蚕核型多角体病毒(BmNPV:Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)引发的蚕脓病严重危害养蚕业,该病传染性强、难以控制,全球由BmNPV引起的蚕茧损失占总损失的50%以上,需迫切寻找新的有效的抗BmNPV病毒的药物以控制蚕浓病。家蚕胸腺素(BmTHY:Bombyx mori Thymosin superfamily protein)是一种重要的免疫因子,前期研究发现BmTHY分布于家蚕细胞的细胞质和细胞核,在5龄幼虫多个组织都有表达,且在家蚕的不同发育阶段存在差异表达,体外实验证明其为胸腺素THY超家族蛋白之一,而且是actin-sequestering(肌动蛋白螯合)蛋白,说明BmTHY参与家蚕细胞基本的生命活动,具有多种生理功能。还发现BmNPV病毒感染BmN细胞及5龄幼虫时,BmTHY可以提高细胞及幼虫的存活率,具有一定的抗病毒作用,但其对病毒侵染及增殖影响的具体环节和内在机制不清楚。
  本课题先构建了BmTHY的过表达和抑制表达体系,以研究过表达和抑制表达BmTHY后对BmNPV增值和复制的影响。首先,用野生型病毒分别感染过表达和抑制表达BmTHY的BmN细胞,感染48h后,取细胞上清,用TCID50终端稀释法分析各组细胞的病毒滴度,结果显示:随着感染时间的延长,过表达BmTHY组的滴度值明显比对照组滴度值低:在感染168h,过表达BmTHY组的滴度值是对照组滴度值的42%;但是,抑制表达BmTHY组的滴度值明显比对照组滴度值高:在感染168h抑制表达BmTHY组的滴度值是对照组滴度值的2.37倍。结果说明过表达BmTHY对BmNPV病毒的增殖起到了抑制作用。
  其次,在过表达和抑制表达BmTHY48h后,用BmNPV-RFP感染各组细胞,在感染48h后,荧光显微镜下观察,相对于对照组细胞,过表达组发红色荧光明显减少,而抑制表达组发红色荧光明显增多。qRT-PCR分析结果表明:过表达BmTHY时gp41的基因拷贝数降低,而在抑制BmTHY表达时则升高。这些结果进一步说明了在BmN细胞内,BmTHY可以抑制BmNPV的复制和病毒蛋白的表达。
  最后,为了更进一步探究BmTHY的抗病毒机制,通过提取BmN细胞总蛋白,以BmTHY抗体为诱饵,IgG兔抗为对照,采用免疫共沉淀的方法,即内源性Co-IP(Co-immunoprecipitation)证明:在细胞内BmTHY蛋白与actin蛋白有相互作用。这个结果证明了BmTHY与actin的互作可能影响细胞骨架,是BmTHY抗病毒的机制之一。由于BmNPV杆状病毒侵染宿主细胞时,其病毒粒子的复制需要借助于微管蛋白。随后用BmNPV分别感染过/抑制表达BmTHY的BmN细胞后,采用不同缓冲溶液分别提取F-actin(Fibrous actin)和G-actin(Globular actin)蛋白,然后各取等量蛋白Western blotting分析检测过/抑制表达BmTHY的BmN细胞中F-actin和G-actin蛋白量的变化情况,分析各组F/G-actin比值。结果表明:相对于对照组,过表达组F-actin/G-actin升高了20.4%。相反,与对照组相比,抑制表达组的F-actin/G-actin降低了39.8%。上述实验结果表明:在BmNPV侵染BmN细胞时,BmTHY对actin的聚合产生影响,进而影响微管蛋白的结构和功能,从而进一步影响BmNPV侵染能力。
  综上所述,BmTHY是家蚕重要的免疫因子,能够抑制BmNPV病毒的增殖和复制,并且是通过与actin的互作抑制病毒的增殖和复制。
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