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[硕士论文] 庞运国
脊柱骨病外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤是儿童和青少年来源于间叶组织的最常见的恶性肿瘤。由于其发病率较低,对骨肉瘤发病机制的认识仍较少。而且,已经发生肺部转移的骨肉瘤患者的死亡率仍较高。因此,有必要从分子水平研究骨肉瘤发生发展的分子机制,有助于提高骨肉瘤的治疗效果。代谢型谷氨酸受体4(GRM4)已被证明与骨肉瘤的发病机制有关。但是,GRM4在骨肉瘤细胞中的作用和潜在的分子机制仍不清楚。
  目的:
  检测GRM4基因在不同入骨肉瘤细胞株和人成骨细胞中mRNA表达水平;采用RNA-seq技术获得骨肉瘤GRM4高表达细胞株U2OS GRM4敲减前后的差异表达基因;探讨GRM4在骨肉瘤中潜在的分子作用机制。
  方法:
  1、采用实时定量PCR检测4株人骨肉瘤细胞(HOS、MG-63、U2OS和Saos-2)和人成骨细胞hFOB1.19的GRM4mRNA的表达水平。
  2、根据GRM4基因mRNA的序列信息设计合成3条siRNA和1个阴性对照靶点,筛选出干扰效果最好的干扰靶点,构建针对GRM4的干扰慢病毒载体。
  3、用慢病毒介导的小干扰RNA转染GRM4mRNA最高表达的U2OS细胞株。通过嘌呤霉素筛选获得稳定的转染体。
  4、用实时定量PCR和western blot方法检测GRM4的敲减效率。
  5、通过全转录组测序技术筛选得到GRM4沉默前后的差异表达基因并用生物信息学方法进行分析。
  6、此外,通过生物信息学分析方法预测靶向GRM4基因的上游转录因子以及构建下游蛋白质相互作用网络。
  结果:
  1、人骨肉瘤细胞MG-63、U2OS、HOS、Saos-2中GRM4mRNA的表达水平相对高于人成骨细胞hFOB1.19,其中U2OS细胞株的表达水平最高。
  2、所设计的3条干扰靶点序列,其中S1的沉默效果最显著,用作后期实验。
  3、慢病毒介导的GRM4-siRNA在mRNA以及蛋白水平均显著抑制U2OS细胞GRM4的表达。
  4、总共获得51个差异表达基因,其中包括14个表达上调和37个表达下调的差异表达基因。差异表达基因的KEGG通路富集分析表明共获得4条显著富集的信号通路。
  5、总共获得6个可能参与GRM4基因转录调控的转录因子,蛋白质相互作用网络上的182个基因富集在14条信号通路上。其中,趋化因子及趋化因子受体被发现主要富集在3条信号通路上。并且,在GO分类中的分子功能中,趋化因子和趋化因子受体主要显著富集在趋化因子结合、趋化因子活性、趋化因子受体活性、趋化因子结合、C-C趋化因子受体活性、C-C趋化因子结合和细胞因子活性。
  结论:
  1、相对于人成骨细胞,GRM4在人骨肉瘤细胞株中呈高表达。
  2、4条显著富集通路上的差异表达基因可能通过GRM4参与骨肉瘤细胞的发生和进展过程。
  3、EGR1和CTCF可能起肿瘤抑制因子的作用参与GRM4基因的转录调控,并且GRM4通过与下游的趋化因子和趋化因子受体的相互作用参与骨肉瘤的进展。
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