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摘要:文章以国家精品在线开放课程《动物遗传学》教学过程为例,对在线开放课程的教学资源、教学结构、教学观念、评价体系进行精心组织与合理设计,旨在使学习活动个性化,强化自主学习能力,提高课程教学质量,为同类课程的建设提供参考....
摘要:自2003年教育部开启了国家精品课程建设工作,之后搭载互联网+的传播途径,课程组开展了精品开放课程建设和教学改革以及在线开放课程建设应用的教学模式.2015年《动物遗传学》被批准在江苏省精品在线开放课程网站运行.经过3个轮回的应用,从中感受到了一些互联网对教学带来的优势冲击,也激起了对在线开放课程教学模式需要改进的一点思考.该文就个人对在线开放课程的理解、对在线开放课程几个教学模式的应用、在线开放课程与翻转课堂结合形成线和向下混合教学模式浅谈一点体会....
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要.为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus) FGF8的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能.根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到pGMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1.以qRT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的shRNA载体进行慢病毒包装.在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用qRT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率.结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为shFGF8-1、shFGF8-2、shFGF8-3,其中shFGF8-2干扰效率最佳.将shFGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×108 TU/mL、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体.对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P<0.01),PGC标记基因Cvh C-kit表达极显著上调(P<0.01).此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH+PGCs比例显著增加(P<0.01).本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成....
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为配子的原始祖细胞,参与胚胎生殖细胞的发育过程.类固醇激素通路中3β羟基类固醇脱氢酶2(3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,Hsd3β2)能促进细胞分化,但其对原始生殖细胞的形成具体调控机制还不得而知.本研究旨在通过构建类固醇激素合成过程中关键基因Hsd3β2的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰载体并研究其对鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞分化为原始生殖细胞的影响.通过慢病毒包装Hsd3β2感染鸡胚胎干细胞并进行RNA干扰(RNAinterference,RNAi)诱导,分别于2、4、6d观察细胞形态变化并收集细胞样品,qRT-PCR检测Hsd3β2、生殖标记基因鸡Vasa基因同系物(chicken vasa homologue,Cvh)、鸡KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(chicken KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase,C-kit)及甾类激素合成信号通路下游基因细胞色素P450亚酶(cytochrome P450 subenzyme,Cyplal)、葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A1,Ugt1a1)和17β羟基类固醇脱氢酶7(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase7,Hsd17b7)表达;流式细胞检测诱导产生类胚体阳性率;在鸡胚孵化过程中鸡胚注射慢病毒干扰载体,孵化4.5 d后收集生殖嵴,qRT-PCR检测Cvh、C-kit及下游基因Cyp1a1、Ugt1a1和Hsd17b7表达;流式细胞分析原始生殖细胞生成效率.本实验成功构建sh-Hsd3β2慢病毒载体,挽救实验表明过表达Hsd3β2能使shRNA引起的基因表达下降回升;在体外诱导过程和鸡胚孵化过程中,qRT-PCR结果表明干扰Hsd3β2后,甾类激素合成信号通路中的下游基因的表达显著下调(P<0.01);在RA诱导实验过程中,随诱导时间推进,类胚体数量逐渐增加.Hsd3β2抑制后,类胚体形成数量减少.Cvh、C-kit在诱导过程中上调表达,但Hsd3β2干扰后,其表达显著降低(P<0.01),流式细胞分析表明干扰Hsd3β2后,诱导4d后产生类胚体阳性细胞(3.27±0.19)%显著低于对照组(7.39±0.09)%;体内实验结果表明干扰Hsd3β2后,Cvh、C-kit表达显著降低(P<0.01),生殖细胞数量显著减少.本研究结果表明Hsd32能通过甾类激素合成信号通路促进原始生殖细胞的形成,为研究该通路对原始生殖细胞形成具体机制提供理论基础....
摘要:克隆如皋黄鸡LBC(Libichun)基因CDS区,通过GFP LBC融合蛋白和间接免疫荧光法(IFA)来实现该基因的亚细胞定位,为其基因功能研究奠定基础.提取如皋黄鸡18日龄的鸡胚睾丸RNA,巢式PCR方法扩增LBC基因的CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N1 LBC转染DF 1细胞,48 h后观察其绿色荧光表达情况,同时制备LBC基因的多克隆抗体,利用IFA标记LBC基因的表达部位.本研究成功克隆出如皋黄鸡LBC基因的完整编码区,成功制备抗体和构建pEGFP-N1-LBC、pcDNA3.0 LBC.GFP LBC融合蛋白和IFA的结果显示,如皋黄鸡LBC基因在细胞质和细胞核中都有表达,为下一步LBC基因的功能研究奠定了基础....
摘要:为克隆如皋黄鸡Stra8基因的3'UTR,寻找靶向Stra8基因的microRNA(miRNA),以鸡精原干细胞的cDNA为模板,根据NCBI数据库Stra8的CDS序列设计引物,通过3'RACE技术克隆Stra8基因的3'UTR,并构建相应的荧光素酶表达载体和突变载体;利用生物学预测软件对靶向Stra8 3'UTR的miRNA进行预测,选择评分最高的miRNA进行慢病毒载体构建;以pRL-TK为内参,分别将miRNA与Stra8 3'UTR荧光素酶表达载体和突变载体共转染DF-1细胞,利用双荧光素酶基因报告系统对miRNA进行活性检测.结果表明,采用3'RACE技术成功克隆Stra8 基因的3'UTR;Targetscan生物在线软件预测到靶向Stra8基因的4个特异性较高的miRNA,并成功构建其相应的慢病毒载体;双荧光素酶活性检测结果显示,gga-miR-1a、gga-miR-31、gga-miR-218均可通过3'UTR序列抑制Stra8基因的表达,其中gga-miR-31抑制效果最佳.该结果可为后续深入探讨gga-miR-31介导调控的Stra8基因在雄性生殖细胞分化中的调控网络提供依据....
摘要:本研究旨在检测CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)基因的组织表达特异性,克隆其编码区并构建重组载体转染DF-1 (D fibroblast-1,DF-1)细胞并制备多克隆抗体,为初步研究鸡(Gallus gallus) CREPT基因参与调控细胞周期的生物学功能提供理论依据.以鸡生殖嵴cDNA为模板扩增CREPT基因CDS区,并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析.将该基因与pcDNA3.1和pEGFP-N1载体相连获得重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT之后,转染鸡DF-1细胞,并采用基因免疫法制备CREPT基因多克隆抗体并检测效价,利用qRT-PCR检测过表达CREPT基因后DF-1细胞内相关基因的表达情况.生物信息学分析发现,鸡CREPT编码区序列总长978bp,编码325个氨基酸,该氨基酸序列中存在一个RPR结构域(regulation of nuclear pre-mRNA domain)和卷曲结构域;以原鸡(G.gallus)CDS序列为模板成功克隆的如皋黄鸡(G.domesticus)CREPT基因长978 bp,测序结果准确,与原鸡CDS序列一致,同源性100%;组织表达谱分析显示,CREPT在睾丸、卵巢和大脑中mRNA表达量较高(P<0.01),而在肠组织(P<0.01)、骨骼肌(P<0.05)和脾脏(P<0.05)中的mRNA表达量较低;成功构建重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT;转染融合表达载体pEGFP-CREPT后显示,CREPT表达于DF-1细胞质中;使用基因免疫法制备多克隆抗体血清,免疫荧光检测(immunogen fluorescent assay,IFA)检测显示,制备的多克隆抗体最佳效价为1:10,Western blot证实,pcDNA3.1-CREPT真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,qPCR检测结果表明,pcDNA3.1-CREPT载体能够在DF-1上过表达CREPT基因,并引起细胞周期调控相关基因p15RS(P 15 related gene on G 1/S progression)、转录因子4(transcription factor 4,TCF4)、细胞周期蛋白D1(cyclinDI)和β-链蛋白(b-catein)的表达变化.本研究成功克隆了鸡CREPT基因,并制备了具有特异性的多克隆抗体,该基因在DF-1细胞质中表达,CREPT基因的表达能下调pl5RS基因的表达(P<0.01),上调TCF4(P<0.05)、cyclinD1 (P<0.01)和b-catein (P<0.01)的表达,该研究结果为进一步研究鸡CREPT基因的生物学功能提供了理论依据....
摘要:论文旨在确定Dazl基因核心启动子活性调控区,并比较不同诱导剂的诱导效率,筛选出最佳基因诱导剂.用PCR技术扩增不同长度的Dazl基因启动子,插入到pEGFP-N1和/或pGL3-basic载体中,构建重组载体;再将这些重组载体分别转染DF-1细胞系和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Dazl基因启动子核心活性区域;添加单因素或多因素诱导因子,比较不同诱导剂以及诱导剂组合对鸡Dazl基因启动子活性的影响大小.如皋黄鸡Dazl基因的-932 bp~-186 bp区域在DF-1和GC-1两种细胞中,都有不同程度的启动活性,而-186 bp~-39 bp启动子活性几乎完全丧失;诱导剂筛选结果表明,FSH+E2组和Am80组、E2组能够显著提高Dazl基因启动子的活性,RA组、ATRA组、FSH组和睾酮组都不同程度地提高了启动子的活性,而睾丸提取液和BMP4对启动子活性没有显著影响.通过体外诱导实验筛选出如皋黄鸡Dazl基因最适诱导剂,为鸡ESCs体外向雄性生殖细胞分化的细胞诱导剂进一步筛选奠定了基础....
摘要:本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据.基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率.Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%.通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除....
摘要:旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制.采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到pEGFP-N1和pGL3-Basic载体,构建重组载体.将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化.双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370 ~-36 bp,在-370 ~-166bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著.本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考....
摘要:试验分别探讨了睾酮和FSH诱导鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果.首先筛选睾酮和卵泡刺激素(FSH)的适宜诱导浓度,在RA和支持细胞的诱导基础上分别添加适宜浓度的睾酮和FSH对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果显示:睾酮和FSH的适宜诱导浓度分别为15 ng/mL和25 ng/mL,单独使用睾酮和FSH诱导均未出现类SSCs样细胞;二者联合支持细胞和RA诱导,诱导2d出现类胚体,随后类胚体体积逐渐变大,诱导12d类胚体解体出现类SSC样细胞;实时荧光定量PCR结果显示,睾酮和FSH分别与支持细胞和RA共同诱导组中,Stra8表达量持续上调,integrinβ1、Dazl表达量显著上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下降趋势;睾酮的多因素诱导组中,Dazl的表达量明显高于RA和支持细胞诱导组;而FSH的多因素诱导组中Stra8的表达量相对于RA和支持细胞诱导组也显著升高.结果表明睾酮和FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但可以促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza 2'-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据.PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48 h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对Nanog基因启动子活性的影响.选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测.结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5 Azadc+ TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高Nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性....
摘要:【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞(spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO(Gene ontology)分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸(retinoic acid,RA)以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸(piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR (quantitative real time PCR)检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现:在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组(BLANK)【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。...
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE? T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:①前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”:以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”:以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化:按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA(EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg)和脂质体2000的比例为1?0.5、1?1.0、1?1.5、1?2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组(P<0.05),且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组(山羊成纤维细胞正常生长组)。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。...
摘要:本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率.将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个细胞浓度,使用悬滴培养后,观察类胚体的形成效率.对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察,qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达,免疫细胞化学检测相关蛋白的表达,并进行类胚体自分化检测和核型分析.3×104 mL-1细胞浓度生成的类胚体数量最高,单个视野下可观察到约267个类胚体,且形成的类胚体大小均一,呈圆球状.qRT-PCR检测结果表明,在类胚体形成48 h内,干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达.免疫细胞化学检测显示,该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性.自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性.核型分析显示,悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型.鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×104 mL-1,且形成的类胚体可分化成3个胚层,用于体外定向诱导过程.本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础....
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北大核心 CSTPCD
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摘要:随着人类测序技术的发展与成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用.基因编辑技术主要是通过在外源DNA靶位点上产生双链切口,从而诱导出同源重组修复或非同源末端连接,进而实现基因组的编辑.目前ZFN和TALEN技术被广泛运用,虽然在一定程度上获得明显的效果,但因设计复杂,成本较高,使其运用有所局限.CRISPR/Cas技术近年来凭借其高效、精确的编辑成为最新一代的基因编辑技术.本文就以上3种基因打靶技术的作用原理、应用及优缺点作简单概述,为基因编辑的实践应用提供理论基础....
摘要:旨在确定鸡Stra8基因启动子的主要调控区域,预测调控元件结合位点,探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)诱导对Stra8启动子活性的调控作用.将鸡Stra8基因5 '侧翼系列缺失片段插入到pGL3-basic载体构建重组质粒,并转染DF-1和GC-1,通过检测荧光素酶活性和预测启动子区域调控元件的结合位点,选取合适的启动子片段并构建其重组质粒Stra8-EGFP;将Am80和TSA分别按一定的浓度梯度诱导转染细胞,进行荧光素酶活性检测以筛选最佳诱导浓度;用最适剂量的Am80和TSA分别单独或联合诱导转染重组质粒Stra8-EGFP的P19,并检测各诱导组的绿色荧光表达程度.结果表明,鸡Stra8基因启动子-1 055~+54bp片段的活性较强,且含有RARα、RXRα和RARβ的结合位点;分别单独或联合使用Am80和TSA对转染的细胞进行诱导,结果显示,Am80和TSA协同作用的荧光素酶活性最高;重组质粒Stra8-EGFP转染细胞后,用Am80 (10-5 mol·L-1)和TSA(10-6 mol·L-1)联合诱导可见绿色荧光强度最强.本研究成功分析了鸡Stra8基因启动子的活性和调控元件的结合位点,确定Am80和TSA共同诱导可显著提高Stra8基因启动子调控活性....
摘要:将受体种蛋分为3组,分别经换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗后,比较3种开窗方法对孵化率的影响;分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs,比较显微注射时3种不同的处理方法对孵化率的影响;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测.结果表明:赤道面开窗法的孵化率显著高于换壳法和钝端开窗法(P<0.01);开窗后,显微注射经转染的ESCs组孵化率显著低于其他2组(P<0.01);PCR检测结果显示,有四只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中两只鸡的性腺发生EGFP基因的嵌合.表明赤道面开窗后,对受体鸡胚下腔显微注射经转染的ESCs可以生产嵌合体鸡,产生嵌合体鸡的效率为4.17%....
摘要:试验旨在探究不同注射部位和剂量对鸡胚孵化率及发育的影响,为鸡胚注射试验提供帮助和指导.以新鲜受精鸡蛋为材料,分别在鸡蛋的尖端、赤道面和钝端注射不同剂量的生理盐水,比较不同注射部位和剂量对种蛋孵化率的影响;分别在3个位置注射台盼蓝染液,观察记录鸡胚的发育情况.结果表明:不同注射部位对种蛋孵化率无显著性影响(P>0.05);种蛋孵化率随注射剂量的增加明显下降,注射100 μL剂量的种蛋孵化率明显高于其他剂量水平.不同注射位置和剂量的生理盐水对鸡胚发育的影响并不显著;台盼蓝注射后胚胎发育情况表明,在胚胎发育初期赤道面注射的扩散效果最好....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测.同时用Oct4启动子-1516~+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性.结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游-1516~+30 bp,基本活性区域为-238~+30 bp;在-1516~-946 bp、-615~-96 bp区域存在正调控元件,在-1936~-1516 bp、-946~-615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μtmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;-1516~+30 bp片段能够启动GFP的表达.研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础....
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