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摘要:CRISPR/Cas9是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术.该系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统,与TALEN和ZFN技术设计相比更加简单、更容易操作,目前,该技术已成功应用于人类细胞、细菌、斑马鱼、猪、小鼠、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰,是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一....
[硕士论文] 尹畅
环境科学与工程 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是一种极为重要的n-3多不饱和脂肪酸,具有抗癌、抗炎、预防心血管疾病的作用,并能促进婴幼儿神经系统和视觉系统的发育和成熟。而裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)是属于破囊壶菌科的一类海洋真菌,体内积累了大量的DHA,是目前已知的DHA含量最高的海洋真菌,因其具有的重要经济价值而备受人们关注。因此通过对裂殖壶菌DHA合成途径的研究,利用生物工程方法来最大限度提高裂殖壶菌DHA产量,具有极为重要的生物学意义和经济价值。
  CRISPR/Cas9是一种高效准确的新兴基因编辑技术,目前已应用该技术成功在多个物种实现基因编辑。本文旨在以裂殖壶菌为研究对象,通过构建相应的CRISPR/Cas9基因编辑系统,对裂殖壶菌中与脂肪酸合成相关的基因进行敲除,并替换为Zeocin抗性基因片段,初步探索CRISPR/Cas9基因编辑系统在海洋真菌裂殖壶菌中的应用,以及相关基因敲除后对脂肪酸产量的影响。据此,本实验的主要内容及研究结果如下:
  (1)为了确定本实验的选择标记基因,从而能够成功筛选出转化菌株,本实验选取了基因工程中常用的抗生素Zeocin、氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan),分别研究其对裂殖壶菌生长的影响,结果表明,浓度为50μg/mL和100μg/mL的氨苄青霉素和卡那霉素对裂殖壶菌的生长基本没有影响,而Zeocin抗生素浓度为50μg/mL时,裂殖壶菌的生长受到一定的抑制作用,当Zeocin浓度为100μg/mL时,裂殖壶菌的生长被完全抑制,且到第十天仍没有菌落出现,所以本研究选择Zeocin作为裂殖壶菌的抗性筛选试剂,筛选浓度浓度为100μg/mL。
  (2)根据专门的设计网站https://www.dna20.com/products/crispr设计出用于敲除裂殖壶菌PKS亚基PksD基因的gRNA序列,并将该序列构建进能够高效表达CRISPR/Cas9系统的pCRISPR-Schi载体中。利用重叠延伸PCR克隆出带有PksD基因上下游区域同源序列的Zeocin抗性基因片段,通过电转化方法将该片段与CRISPR载体转入裂殖壶菌中,成功得到PksD基因敲除的裂殖壶菌菌株,且转化效率达到80%。而通过对转化菌株和野生型菌株生物量的测定可知,细胞干重并没有太大差异,说明CRISPR载体和抗性基因片段的插入对菌株的正常生长没有太大影响,也进一步说明CRISPR/Cas9基因编辑系统适用于海洋真菌裂殖壶菌,并且能够快速、高效地对裂殖壶菌进行相关基因的敲除与加入。
  (3)对敲除PksD基因的裂殖壶菌阳性菌株,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对其脂肪酸含量进行测定,结果发现,转化菌株与野生型菌株相比,各转化菌株总脂含量均有一定程度的提高,而脂肪酸的组成没有发生变化,但与野生型菌株相比,转化菌株的DHA含量降低约20%,说明PksD基因的破坏对总脂和DHA的合成产生了影响,进一步说明PksD基因在裂殖壶菌脂肪酸合成的PKS途径中起着比较重要的作用。该体系的构建为后续运用CRISPR/Cas9系统研究裂殖壶菌的基因功能奠定了基础。
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