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[专利] 发明专利 CN201811381001.X
扬州大学 2019-03-26
摘要:本发明提供了一种分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用。本发明的分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势,基于此建立的鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体竞争ELISA检测方法具有较好的灵敏度和特异性,用作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病相关的研究。
[硕士论文] 尹克全
生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鸡白痢沙门菌是宿主特异性致病菌,多侵害21日龄以内的雏鸡,引起白色痢疾,发病率和致死率极高;成年鸡感染后一般无临床症状,但使其处于持续带菌状态,导致体重减轻,产蛋量下降。鸡白痢沙门菌含有很多致病基因,其中ipaJ基因是在鸡白痢沙门菌中新发现的与毒力相关的基因,其编码的IpaJ蛋白参与细菌对机体的早期感染过程。研究表明ipaJ基因广泛存在于鸡白痢沙门菌中,且为鸡白痢沙门菌血清型所特有的基因,与其亲缘关系较近的其他血清型沙门菌则不含有该基因,如鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌等。本研究克隆表达了鸡白痢沙门菌ipaJ基因,制备了IpaJ蛋白的单克隆抗体并建立了相应的检测技术,为鸡白痢沙门菌致病机制的研究和疾病诊断提供了重要的生物学材料。
  1鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆及表达
  以鸡白痢沙门菌C79-13和福氏志贺菌SNI基因组为模板分别PCR扩增ipaJ基因。将ipaJ基因分别与原核表达载体pColdI和pMAL-c5X相连接构建重组原核表达质粒,通过双酶切以及测序鉴定,结果表明ipaJ基因成功克隆至原核表达载体上,且没有任何碱基突变。将构建成功的重组质粒分别命名为pColdI-SP-ipaJ(Salmonella Pullorum)、pMAL-c5X-SP-ipaJ(Salmonella Pullorum)和pMAL-c5X-SF-ipaJ(Shigella flexneri)。将重组原核表达质粒通过热激法转入原核表达宿主菌BL21(DE3)和ER2523,分别经0.5mM和0.3mM IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western Blot验证,结果表明重组蛋白条带大小分别为31.8kDa、73.5kDa和71.3kDa。将诱导表达的蛋白产物通过割胶纯化法和免疫亲和层析柱方法纯化目的蛋白,Western Blot结果表明所纯化的目的蛋白具有良好的免疫反应性,表明成功获得了重组蛋白rHis-SP-IpaJ(Salmonella Pullorum)、rMBP-SP-IpaJ(Salmonella Pullorum)和rMBP-SF-IpaJ(Shigella flexneri)。
  2鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的制备
  将割胶纯化的重组蛋白rHis-SP-IpaJ免疫6-8周龄BALB/c小鼠,经3次免疫后,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以纯化获得的重组蛋白rMBP-SP-IpaJ作为检测原蛋白,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,经过3次检测,最终确定获得8株稳定分泌特异性IpaJ单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1C3、1F3、2D9、3B5、3D8、4D5、4G6和5D1。亚型鉴定结果显示1C3、2D9、4G6和5D1为IgG1型,3B5和4D5为IgM型,1F3和3D8为IgG2b型。以间接ELISA方法测定其细胞上清效价,结果显示1C3、2D9和3B5为200,1F3和3D8为1600,4D5、4G6和5D1为6400;制备上述8株杂交瘤细胞腹水并以间接ELISA方法测定其腹水效价,结果显示1C3为2000,1F3为256000,2D9为1000,3B5为4000,3D8和4D5均为128000,4G6为2048000,5D1为4096000。ELISA和Western Blot结果显示所获得8株单抗均与相应的融合蛋白rHis-SP-IpaJ、rMBP-SP-IpaJ和rMBP-SF-IpaJ有良好的反应性,而与对照组BL21(DE3)-pColdI和ER2523-pMAL-c5X空载体细菌不发生反应。特异性鉴定结果显示8株单抗只与相应的重组融合蛋白有反应,与其他重组融合蛋白均无交叉反应。
  3鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的初步应用
  应用HRP酶标记4G6单克隆抗体检测鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白的体外表达情况,并以重组蛋白rMBP-SP-IpaJ作为检测抗原建立针对鸡白痢病的竞争ELISA检测方法。①Western Blot结果表明鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白能够在体外LB培养条件下正常表达。②当血清工作浓度为1∶10时,利用竞争ELISA方阵实验确定重组抗原蛋白rMBP-SP-IpaJ包被浓度为0.5μg/mL,酶标竞争抗体4G6工作浓度为1∶16000;以梯度实验确定血清最佳工作浓度为1∶2。基于实验数据绘制ROC曲线并确定其灵敏度为0.906,特异度为0.762,Cut-off值为40.5,统计分析p<0.05,鸡白痢阳性血清对酶标抗体4G6有显著的抑制作用。应用建立的竞争ELISA检测技术对某养鸡场的200份临床血清样本进行检测,阳性检出率为2%。表明基于鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白单克隆抗体建立的竞争ELISA检测技术对鸡白痢病诊断有良好的应用前景。
[专利] 发明专利 CN201710296593.4
扬州大学 2017-07-21
摘要:本发明属于微生物领域,具体涉及一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法及其应用。所述方法为采用外源自杀载体将沙门菌中的多拷贝质粒进行消除。整个过程简单,快速,稳定,高效。为研究这些质粒的功能奠定基础。
摘要:利用原核表达载体pCold Ⅰ构建肠炎沙门菌转录调控蛋白HilD和HilA的重组表达菌,并采用Western-blot技术检测两者在体外培养条件下的表达规律.结果表明:成功构建了重组表达大肠埃希菌(E.coli) BL21(pCold Ⅰ-hilD)和E.coli BL21(pCold Ⅰ-hilA),经IPTG诱导得到了重组表达的rHis-HilD和rHis-HilA蛋白.将重组表达的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备蛋白的多克隆抗体,Western-blot进一步证明了抗体与蛋白可发生特异性反应.肠炎沙门菌C50041在LB培养条件下,HilD与HilA蛋白表现出不同的表达规律,从而为体外研究肠炎沙门菌SPI1与SPI2效应蛋白的表达和功能研究奠定了基础....
摘要:为揭示不同鸡白痢沙门菌菌株间的毒力差异,本研究对1960s-2010s期间不同来源的50株鸡白痢沙门菌的毒力进行分析,通过比较细菌对HD-11细胞的黏附率,并在其中挑选代表菌株利用鸡胚模型进一步筛选毒力强的菌株。取新鲜培养的鸡白痢沙门菌菌液以MOI=10∶1感染禽巨噬细胞系(HD-11)与鸡胚成纤维细胞系(DF-1),1h后裂解细胞并稀释涂板计数以计算其黏附率,S06004对HD-11的黏附率高于DF-1,证实HD-11细胞更适合作为鸡白痢沙门菌的细胞模型;并将S06004对HD-11细胞的黏附率设为1,以其它菌株的黏附率与S06004黏附率的比值来反映各菌株感染细胞的相对能力,结果表明,大部分菌株的黏附率与S06004相当,而四株细菌7101、B8605、S9804、S9876的感染率偏高,并且S9876的黏附率约是S06004的6倍。根据黏附结果,从50鸡白痢沙门菌中挑选10株为代表菌株,以103 CFU/100μ L的剂量尿囊腔接种16日龄海兰白鸡胚,并设立空白对照组,监测并统计孵育第17-20天的鸡胚死亡情况,初步筛选获得了3株鸡白痢沙门菌毒力较强的菌株:C79-13、6803和6201,其中6803和6201分离自上世纪60年代。本研究建立了鸡白痢沙门菌菌株毒力研究的模型,为进一步研究鸡白痢沙门菌的致病性提供了理论基础。
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