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摘要:概述了紫外线的种类及其对人体的影响;综述了防晒剂的分类和作用机理,介绍了防晒剂的评价指标和方法,并分析了防晒剂的发展趋势;提出了通过合理修饰改造蛋白质分子,研制安全、高效的新型防晒剂的设想.
[硕士论文] 寿露
生物学(生物化学与分子生物学) 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:紫外线是位于日光高能区的不可见光线,按波长可分为UVA、UVB、UVC。合适剂量紫外线可促进人体维生素D的合成。过量紫外线的照射则会引起皮肤的不适甚至疾病。因而,对于紫外线的防护以及防晒剂的开发逐渐受到广泛重视,研制广谱、高效的紫外线阻挡和吸收剂是当前防晒研究的热点之一。
  链霉亲和素蛋白(Streptavidin,以下简称SA)是从亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)分泌物中得到的一种蛋白质。其单体的二级结构由八条反向平行β-链组成,进而折叠形成反向平行β-桶形三级结构。其对生物素表现出极强的亲和性,每个桶状亚基都能结合一个生物素分子。四个相同的链霉亲和素蛋白单体可缔合形成四聚体。链霉亲和素中,芳香族氨基酸比例达10.08%,其中色氨酸占比4.20%,其对280nm紫外线具较高消光系数。且色氨酸可吸收酪氨酸等传递的能量释放荧光。这些最大荧光强度出现在340nm附近的紫外线若进一步被化合物(例如香豆素类化合物)吸收,即可据此制成吸收波长涵盖260~350nm的广谱紫外吸收剂。
  本研究通过克隆具有天然活性的核心SA序列,并以之为基础连接类生物素短肽序列以抑制SA与表达菌胞内生物素的结合,从而保证宿主生物素正常代谢。考虑类生物素短肽与生物素结合位点间距,选取包含八个氨基酸的人鼻病毒3C蛋白酶特异性识别序列LEVLFQGP连接SA与类生物素短肽。以亲和素链霉菌基因组DNA为模板,经PCR获得长度为357bp的SA片段。再以所得SA为模板,进行第二次PCR获得含有类生物素短肽序列的基因片段SA1。对SA1定点突变(G59K、Y68G、L94K、W105S、H112K)后,即口获得具高赖氨酸比例的目的序列SA2,以期增加蛋白的可溶性。
  参考已有研究,选定两种载体pHND和pET-24a分别对SA2蛋白以0.5mMIPTG诱导表达并纯化,其中对pET-24a载体的SA2诱导条件进行优化。实验发现,在16℃,16h诱导后,SA2的表达量更多。比较两者纯化的得率与纯度后发现,pET-24a多聚组氨酸标签融合蛋白在Ni-NTA亲和层析的洗脱液中未经发现,从而确定SA2不适用Ni-NTA纯化法。而带YND标签的融合蛋白SA2不仅表达量较多,且因其实际上携带有两个标签——多聚组氨酸标签与YND(Yeast3',5'-Bisphosphate Nucleotidase,酵母3',5'二核苷酸酶亦称HAL2),经由两个亲和层析柱Ni-NTA柱与PAP(3',5'-Bisphosphate adenosine,3',5'二磷酸腺苷)柱的纯化,得到纯度较高的目的蛋白SA2。
  依据相关文献数据,由筛选后得到的香豆素类化合物7-甲氧基香豆素-3-羧酸-N-琥珀酰亚胺酯(7-Methoxycoumarin-3-carboxylic Acid N-Succinimidyl Ester,MCSE)作为UVA吸收剂标记SA2,得到MCSE-SA2。荧光光谱显示,MCSE-SA2可吸收280nm紫外线并释放405nm荧光。此结果从侧面证明,SA2蛋白内部的色氨酸与标记的MCSE发生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)。综上可知标记蛋白MCSE-SA2通过色氨酸和MCSE吸收280nm和340nm的紫外线,释放无害的、波长大于400nm的荧光。出于应用考虑,对标记蛋白的安全性作了初步说明。结论为深入探讨利用SA蛋白研制防晒剂奠定基础。
  标记后的链霉亲和素在分类上属于生物工程类紫外吸收剂。其除克服传统化学物理制剂的缺点外,相较一般生物工程制品加强了对UVA(320~400nm)的吸收。总体而言,基于链霉亲和素的广谱紫外吸收剂的研制在给予人们新的防晒选择同时,还为相关防晒品的研发提供了新思路。
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